貝類中大田軟海綿酸的電化學檢測方法
【專利摘要】一種貝類中大田軟海綿酸的電化學檢測方法，屬于電化學檢測【技術領域】，首先是通過在裸金電極表面電聚合硫堇-亞甲基藍復合膜，再利用電極表面修飾技術，將納米金和抗體依次修飾至電極表面，制備一種電化學免疫傳感器；其次是將制備的免疫傳感器用于貝類中大田軟海綿酸的電化學檢測。本發明借助硫堇-亞甲基藍的復合聚合膜和納米金的協同作用使峰電流信號放大，提高傳感器的靈敏度；利用具有特殊分子結構的大田軟海綿酸與其抗體特異性結合生成以陰離子形式存在的免疫產物，能阻礙電極表面電子傳遞的特性，實現非標記電化學檢測。本發明方法用于貝類樣品中大田軟海綿酸的測定,檢測快速，靈敏度高，結果準確可靠。
【專利說明】貝類中大田軟海綿酸的電化學檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于電化學檢測【技術領域】，具體地涉及一種貝類中大田軟海綿酸的電化學檢測方法。
【背景技術】
[0002]大田軟海綿酸(Okadaic acid，0A)屬多環聚醚類脂溶性貝類毒素，是海洋腹瀉性貝類毒素的主要成分。OA可通過食物鏈富集于貝類等濾食性海洋生物體內，導致消費者胃腸功能紊亂，出現腹瀉、嘔吐和腹痛等中毒癥狀。研究證實，OA及其衍生物鰭藻毒素能夠抑制蛋白磷酸酶的活性，是一類潛在的腫瘤促進因子，且呈現出發生頻率增加、分布區域擴大、危害日益嚴重的發展趨勢，已成為國際社會共同關注的重大食品和生態安全問題，也是發達國家制定監控計劃和貿易壁壘的主要目標。歐盟、德國和英國等多個國家規定雙殼貝類可食性組織中腹瀉性貝類毒素不大于160 μ g/kg(以OA計)，不過近期歐盟對OA的毒性進行了重新評估，認為現行限量標準不足以保護消費者安全，擬將該限量標準降低到45 μ g/kg0
[0003]目前，檢測大田軟海綿酸的方法有小鼠生物法、液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法和免疫分析法等。小鼠生物法的毒素提取過程繁瑣，需時較長(通常需24h)，且易出現假陽性，檢出限偏高，重現性較差，而液相色譜和液相色譜-串聯質譜法需要價格昂貴的儀器和專業的人員操作，過程復雜，不能實現快速和現場檢測。電化學檢測法具有靈敏度高、操作簡便、快速、經濟、環保等優點，尤其是電化學免疫傳感器分析技術因干擾少，檢出限低，樣品預處理及儀器設備簡單而易實現現場檢測，可提供實時快速、簡單便攜和低成本的分析方法，但在貝類毒素的檢測上應用較少，具有自主知識產權的貝類毒素電化學檢測技術有待突破。
[0004]硫堇屬于吩噻嗪類，具有優良的電化學活性，聚硫堇相對于單體而言有強大的附著力，不易流失，比表面積大，反應活性高，催化效果好；亞甲基藍作為一種生物染料也是一種比較活潑的電子轉移體，在導電基質上具有良好電化學行為，其導電聚合膜具有良好的電化學活性和電催化性能。目前，聚硫堇和聚亞甲基藍作為高性能的電子交換聚合物已被廣泛用作直接電化學電極的功能基質膜和電子媒介體，但鮮有聚硫堇-亞甲基藍復合電聚合膜用于非標記型電化學免疫傳感器的構建。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種貝類中大田軟海綿酸的電化學檢測方法，以克服現有檢測貝類毒素大田軟海綿酸技術上的不足，如儀器復雜、昂貴、步驟繁瑣等缺點。本發明在金電極表面通過循環伏安法電聚合一層聚硫堇-亞甲基藍復合膜，并借助納米金的導電性、生物相容性與高比表面的特性實現抗體的有效固定，利用具有特殊分子結構的OA與其抗體特異性結合生成以陰離子形式存在的免疫產物，能阻礙電極表面電子傳遞的特性，構建了一種非標記型電化學免疫傳感器，結合電化學工作站，實現了對貝類中大田軟海綿酸的電化學檢測。
[0006]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0007]—種貝類中大田軟海綿酸的電化學檢測方法，包括以下步驟:
[0008](I)金電極的預處理:金電極打磨、清洗，再用piranha溶液浸泡,在稀H2SO4溶液中于-1.0?1.55V電位下循環掃描，取出后用水沖洗，吹干；
[0009](2)傳感器的制備:將步驟(2)處理后的金電極置于含有終濃度為lmmol/L硫堇、4mmol/L亞甲基藍、0.lmol/L氯化鉀和pH6.010mmol/L PBS緩沖液的混合溶液中，于+1.5V恒電位下靜置，然后用循環伏安法掃描，形成硫堇-亞甲基藍復合聚合膜；用水充分淋洗金電極后，將其浸于納米金溶液中，以在金電極上獲得納米金層；取大田軟海綿酸單克隆抗體涂覆在金電極表面，室溫下反應；滴加牛血清白蛋白(BSA)溶液以覆蓋多余的非特異性位點，即完成傳感器的制備；
[0010](3)大田軟海綿酸的測定:將不同濃度梯度的OA標準溶液或樣品溶液滴加到步驟
(2)所制備的傳感器表面，反應后，使用電化學工作站進行差示脈沖伏安測量，記錄免疫反應前后峰電流值。
[0011]進一步，步驟(2)所述的納米金溶液的合成方法為:取HAuCl4溶液加熱煮沸，在攪拌回流狀態下迅速加入檸檬酸三鈉水溶液，繼續煮沸，待溶液顏色變為深酒紅時，即完成納米金的合成，其中HAuCl4與檸檬酸三鈉的質量比為1:3。
[0012]進一步，所述的HAuCl4溶液和檸檬酸三鈉的濃度分別為0.01% (重量比)、1% (重量比)。
[0013]進一步，步驟(3)所述的樣品溶液的獲取方法:稱取貝樣，加入甲醇水溶液均質提取，離心后定容；取提取液用氮氣吹干，用PBS緩沖溶液定容，超聲波震使蕩殘留物充分溶解，溶解液過濾膜后待測。
[0014]進一步，所述的PBS緩沖溶液具體是指pH7.4的Na2HPO4-KH2PO4緩沖體系，濃度為10mmol /I, η
[0015]進一步,所述的濾膜為0.45 μ m。
[0016]進一步,步驟(I)所述的金電極用0.05μηι招粉打磨,對打磨后的金電極清洗是依次用超純水、無水乙醇和超純水超聲清洗。
[0017]進一步，步驟(I)所述的稀H2SO4溶液的濃度為0.lmol/L。
[0018]進一步,步驟(I)所述的piranha溶液的成分為濃H2SO4:30%H202=7:3,所述的比例為體積比。
[0019]進一步，步驟(2)所述的循環伏安法掃描的條件是-0.45?0.15V電位、50mV/s速率下掃描25圈。
[0020]進一步,步驟(2)所述的大田軟海綿酸單克隆抗體溶液濃度為0.lmg/mL,所用的體積為20 μ L ;所述的BSA溶液濃度為0.5% (重量比)，體積為20 μ L。
[0021]進一步，步驟(3)中電化學工作站為三電極工作模式，其中傳感器作為工作電極，鉬電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極。
[0022]進一步，步驟(3)中所述的差示脈沖伏安法測量的脈沖范圍是-0.6?0.6V。進一步，步驟(3)中所述的OA標準溶液濃度分別為:0.2、2、10、20和100 μ g/L ;滴加大田軟海綿酸標準溶液所測電流差值與大田軟海綿酸標準溶液濃度的對數呈線性關系，并繪制工作曲線；滴加樣品溶液后記錄其電流的變化值，根據所得到的工作曲線，計算貝類樣品中大田軟海綿酸的含量。
[0023]本發明與現有技術相比的有益效果:
[0024](I)硫堇聚合膜致密穩定，富含構建傳感界面所用的氨基；亞甲基藍加速電極表面的電子傳遞；納米金可提高抗體分子的組裝量，本發明利用硫堇-亞甲基藍的復合聚合膜和納米金的協同作用使峰電流信號放大，提高傳感器的檢測靈敏度。
[0025](2)本發明利用分子結構中含有羧基和酚基的大田軟海綿酸與其抗體結合后可以提供額外的負電荷，生成以陰離子形式存在的免疫產物能阻礙電子傳遞的特性，依據免疫反應前后傳感器界面的電流變化與免疫產物的量成正比關系實現了對大田軟海綿酸的非標記電化學檢測，與標記型電化學免疫傳感器檢測技術相比，簡化了制備和測試過程。
[0026](3)本發明中制備的非標記型電化學免疫傳感器，特異性好，靈敏度高，響應快速，且便攜、小巧，適合現場快速篩選。
[0027](4)本發明的電化學檢測方法，簡化了樣品前處理步驟，經濟、環保且重現性好，結果準確可靠。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1為免疫傳感器修飾過程的電化學交流阻抗表征圖。
[0029]圖2為大田軟海綿酸電化學檢測的電流響應圖。
【具體實施方式】`
[0030]下面通過實施例對本發明的技術方案做進一步解釋，但本發明的保護范圍不受實施例任何形式上的限制。
[0031]一種貝類中大田軟海綿酸的電化學檢測方法，包括以下步驟:
[0032](I)樣品前處理:稱取Ig貝樣于50mL離心管中，加入8mL80%甲醇水溶液，1000Or/min均質提取2min，再以8000r/min離心5min，轉移上清液至IOmL比色管中，并用甲醇定容至10mL。移取ImL提取液氮吹至近干，用10mmol/L PBS (pH7.4)定容至lmL，超聲30s充分溶解殘留物，溶解液過0.45 μ m濾膜后待測。
[0033](2)納米金的合成:取50mL HAuCl4 (0.01%)加熱煮沸，在攪拌回流狀態下迅速加入1.5mLl%檸檬酸三鈉水溶液，繼續煮沸lOmin，待溶液顏色變為深酒紅時，即完成納米金的合成。
[0034](3)金電極的預處理:將金電極用0.05 μ m鋁粉打磨后，置于超純水、無水乙醇和超純水中分別超聲清洗5min，再用piranha溶液(濃H2SO4:30%H202=7: 3)浸泡20min，在
0.lmol/L H2SO4溶液中于-1.0~1.55V電位下循環掃描lOmin，取出后用水沖洗，氮氣吹干。
[0035](4)傳感器的制備:將步驟(3)處理的金電極首先置于含有終濃度分別為lmmol/L硫堇、4mmol/L亞甲基藍、0.lmol/L氯化鉀和10mmol/L PBS (pH6.0)緩沖溶液的混合溶液中，于+1.5V恒電位下靜置IOmin,然后于-0.45~0.15V電位、50mV/s速率下用循環伏安法掃描25圈，形成硫堇-亞甲基藍復合聚合膜；用超純水充分淋洗電極后，將其浸于步驟(2)合成的納米金溶液中4h，以獲得納米金層；取2(^1^大田軟海綿酸單克隆抗體(&社1-(^，0.lmg/mL)涂覆在電極表面，室溫下反應Ih ;最后，滴加20 μ L0.5%牛血清白蛋白溶液(BSA)以覆蓋多余的非特異性位點，置于4°C下保存待用。
[0036]圖1為免疫傳感器修飾過程的電化學交流阻抗表征圖。圖中譜線a為裸金電極的阻抗圖，電阻較小，表明電極表面的電子傳遞只受擴散控制；譜線b為形成聚硫堇-亞甲基藍聚合膜后的電極阻抗圖，界面電子轉移阻力增大，而譜線c為納米金顆粒自組裝到電極界面的阻抗圖，納米金加快了電極表面的電子傳遞，電阻略有減小；當ant1-OA進一步組裝在電極表面后，阻抗值劇增(譜線d)，說明電極表面已形成自組裝抗體層，傳感界面即構建完畢。
[0037](5 )大田軟海綿酸的測定:將20 μ L不同濃度的OA標準溶液(分別為0.2、2、10、20和100 μ g/L)滴加到步驟(4)制備的傳感器表面，反應lh。電極經超純水充分淋洗后，進行差示脈沖伏安(DPV)測量，脈沖范圍為-0.2~0.6V，記錄免疫反應前后峰電流變化。
[0038](6)根據步驟(5)所測電流差值與大田軟海綿酸標準溶液濃度的對數呈線性關系，繪制工作曲線。
[0039]將按步驟(1)處理好的樣品溶液按照步驟(5)的方法進行測試，根據其電流的變化值與步驟(6)得到的OA工作曲線，計算貝類樣品中OA的含量。
[0040]圖2為免疫傳感器對大田軟海綿酸的電流響應圖，內插圖為測定OA含量的校準曲線。不同濃度的OA溶液與電極上的抗體結合，反應前后電流發生變化，用差示脈沖伏安法記錄電流變化大小(反應前電流記為1(1，反應后記為I，電流變化為Δ I=Itl-1),免疫反應前后峰電流的變化值(Λ I)隨著OA濃度的增加而增大，且Λ I與OA濃度的對數線性相關，得出OA的線性范圍為0.2~100 μ g/L，相關系數為0.9920。根據空白信號3倍標準偏差所計算得到OA的檢出限為0.1 μ g/L。
[0041](7)選取四份貝類樣品做加標回收實驗，并與液相色譜-串聯質譜法對比，結果見表1。
[0042]表1貝類中大田軟海綿酸的對比測定結果
[0043]
【權利要求】
1.一種貝類中大田軟海綿酸的電化學檢測方法，其特征是包括以下步驟: (1)金電極的預處理:金電極打磨、清洗，再用piranha溶液浸泡,在稀H2SO4溶液中于-1.0?1.55V電位下循環掃描，取出后用水沖洗，吹干； (2)傳感器的制備:將步驟(I)處理后的金電極置于含有終濃度分別為lmmol/L硫堇、4mmol/L亞甲基藍、0.lmol/L氯化鉀和pH6.010mmol/L PBS緩沖液的混合溶液中，于+1.5V恒電位下靜置，然后用循環伏安法掃描，形成硫堇-亞甲基藍復合聚合膜；用水充分淋洗金電極后，將其浸于納米金溶液中，以在金電極上獲得納米金層；取大田軟海綿酸單克隆抗體涂覆在金電極表面，室溫下反應；滴加牛血清白蛋白溶液以覆蓋多余的非特異性位點，即完成傳感器的制備； (3)大田軟海綿酸的測定:將不同濃度梯度的大田軟海綿酸標準溶液或樣品溶液滴加到步驟(2)所制備的傳感器表面，反應后，使用電化學工作站進行差示脈沖伏安測量，記錄免疫反應前后峰電流值。
2.根據權利要求1所述的電化學檢測方法，其特征在于步驟(2)所述納米金溶液的合成方法為取HAuCl4溶液加熱煮沸，在攪拌回流狀態下迅速加入檸檬酸三鈉水溶液，繼續煮沸，待溶液變為深酒紅色時，即完成納米金溶液的合成，其中HAuCl4與檸檬酸三鈉的質量比為 1:3。
3.根據權利要求2所述的電化學檢測方法，其特征在于所述的HAuCl4和檸檬酸三鈉的濃度分別為0.01% (重量比)、1% (重量比)。
4.根據權利要求1所述的電化學檢測方法，其特征在于步驟(I)所述的金電極用0.05 μ m鋁粉打磨，對打磨后的金電極清洗是依次用超純水、無水乙醇和超純水超聲清洗。
5.根據權利要求1所述的電化學檢測方法，其特征在于步驟(2)所述的循環伏安法掃描的條件是-0.45?0.15V電位、50mV/s速率下掃描25圈。
6.根據權利要求1所述的電化學檢測方法，其特征在于步驟(2)所述的大田軟海綿酸單克隆抗體溶液濃度為0.lmg/mL,所用的體積為20 μ L，所述滴加的BSA溶液濃度為0.5%(重量比),體積為20 μ L。
7.根據權利要求1所述的電化學檢測方法，其特征在于步驟(3)中所述樣品溶液的制備為稱取貝樣，加入甲醇水溶液均質提取，離心后定容；取提取液用氮氣吹干，用PBS緩沖溶液定容，超聲波震蕩使殘留物充分溶解，溶解液過濾膜后待測。
8.根據權利要求1所述的電化學檢測方法，其特征在于步驟(3)中電化學工作站為三電極工作模式，其中所述步驟(2)制備的傳感器作為工作電極，鉬電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極。
9.根據權利要求1所述的電化學檢測方法，其特征在于步驟(3)中所述的差示脈沖伏安法測量的脈沖范圍是-0.6?0.6V。
10.根據權利要求1所述的電化學檢測方法，其特征在于步驟(3)中所述的大田軟海綿酸標準溶液濃度分別為:0.2、2、10、20和100 μ g/L，滴加大田軟海綿酸標準溶液所測電流差值與大田軟海綿酸標準溶液濃度的對數呈線性關系，并繪制工作曲線；滴加樣品溶液后記錄其電流的變化值，根據所得到的工作曲線，計算貝類樣品中大田軟海綿酸的含量。
【文檔編號】G01N27/48GK103713035SQ201410009128
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月9日 優先權日:2014年1月9日
【發明者】郭萌萌, 譚志軍, 吳海燕, 李兆新, 王聯珠, 翟毓秀 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
