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的十二肽抗原模擬表位及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，涉及伏馬菌素B1的十二肽抗原模擬表位，其氨基酸序列為FYTSPGRTSHYM。本發明FB1抗原模擬表位可以替換價格昂貴且毒性強的FB1標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于FB1的免疫學檢測，該抗原模擬表位具有與天然FB1分子相似的免疫反應特性，效果非常好。減少了FB1對人體健康的危害，節約了成本，具有很高的應用價值。
【專利說明】伏馬菌素B1的十二肽抗原模擬表位及其應用

【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及伏馬菌素B1抗原模擬表位及其應用。

【背景技術】
[0002]伏馬菌素B1 (Fumonisins B1, FB1)是一種常見的真菌毒素，主要由串珠鐮刀菌(Fusarium moniIiforme)產生研究表明，FB1對人類及動物具有較強的毒性作用，包括神經毒性、生殖毒性、胚胎毒性及致畸致癌等，國際癌癥研究中心已把FB1化分為2B組，即對人類可能的致癌物。目前，多數國家已經對谷物、糧食及食品中FB1的殘留含量設定了限量標準，如聯合國糧農組織(FAO)規定每日最大允許攝入FB1, FB2, FB3總量為2 Pg/kg體重；瑞士規定糧食中FB1和FB2總殘留限量為1000 Pg/L。
[0003]目前，檢測食品中FB1的方法主要有高效液相色譜、氣相色譜、薄層色譜及免疫學檢測等方法，免疫學檢測方法以其靈敏度高、檢測方便、成本低廉等優勢在FB1的檢測中得到了廣泛的應用。然而，在建立免疫學檢測方法的過程中，必須使用FB1標準品為原料來制備競爭抗原或者固相包被抗原，FB1不僅價格昂貴而且具有極強的致癌性，對檢測人員的健康和環境造成極大的威脅，從而在一定程度上制約了免疫學檢測方法的應用和推廣。有鑒于此，人們開始采用抗獨特型抗體及抗原模擬表位技術來實現有害小分子物質標準品的替代，并取得了一定的進展。噬菌體展示肽庫技術的主要特點是可有效地篩選出與目標靶體特異結合的噬菌體展示多肽，該技術在探索受體與配體之間相互作用結合位點、尋求高親和力生物活性的配體分子、探索未知蛋白質空間結構表位、新型疫苗的研制等方面應用廣泛。
[0004]本發明通過用噬菌體展示肽庫技術，從肽庫中篩選出能與靶分子(抗FB1單克隆抗體)特異性結合的多肽(抗原模擬表位)，該抗原模擬表位具有與天然FB1分子相似的免疫反應特性，通過獲得的FB1抗原模擬表位，以代替價格昂貴且毒性強的FB1標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于FB1的免疫學檢測。


【發明內容】

[0005]本發明以抗FB1單克隆抗體為靶分子，將靶分子固相包被于酶標板上，投入噬菌體隨機展示十二肽庫，進行親和淘選，獲得了七種FB1的抗原模擬表位。它們的氨基酸序列如下:
NNAAMYSEMATD、FYTSPGRTSHYM、IHQELRYTKDSP、GDGVHKSHDIRG、TTLQMRSEMADD、SMLNDYRDYTTH、TRDKSSMLERffP0
[0006]本發明還涉及編碼上述抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸序列，分別對應為: AATAATGCGGCGATGTATTCGGAGATGGCTACTGA、TTTTATACTAGTCCGGGTCGGACGAGTCATTATATG
、ATTCATCAGGAGTTGCGTTATACTAAGGATTCTCCG、GGGGATGGGGTGCATAAGTCGCATGATATCCGTGGG、ACTACGCTTCAGATGCGTAGTGAGATGGCTGATGAT、TCGATGCTTAATGATTATCGTGATTATACTACTCAT、ACTCGGGATAAGTCGTCGATGTTGGAGCGTTGGCCG 上述抗原模擬表位(多肽)結構中，大寫英文字母分別代表二十一種已知天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構體的一種，C代表半胱氨酸殘基，D代表天冬氨酸殘基，P代表脯氨酸殘基，R代表精氨酸殘基，K代表賴氨酸殘基，H代表組氨酸殘基，I代表異亮氨酸殘基，V代表纈氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，F代表苯丙氨酸殘基，E代表谷氨酸殘基，M代表甲硫氨酸殘基，G代表甘氨酸殘基，L代表亮氨酸殘基，Q代表谷氨酰胺殘基，W代表色氨酸殘基，N代表天冬酰胺殘基，A代表丙氨酸殘基，T代表蘇氨酸殘基。
[0007]本發明提及的FBl抗原模擬表位(多肽)可通過噬菌體擴增、化學合成或基因工程重組表達的方式進行大量制備。噬菌體擴增是指將展示有FBl抗原模擬表位(多肽)的噬菌體，通過生物擴增的方式，大量繁殖生產展示有FBl抗原模擬表位(多肽)的噬菌體粒子。化學合成是指依據公布的FBl抗原模擬表位的氨基酸序列，通過化學合成多肽的方式進行多肽合成。基因工程重組表達的方式是指將編碼FBl抗原模擬表位的基因，通過克隆至表達載體，以多肽-融合蛋白的形式進行FBl抗原模擬表位的大量制備。
[0008]本發明還涉及所述伏馬菌素B1抗原模擬表位在免疫學檢測分析中的應用。免疫學檢測的類型包括酶聯免疫吸附檢測、膠體金免疫層析、免疫斑點雜交等基于抗原-抗體特異性反應的免疫學分析檢測類型。
[0009]本發明伏馬菌素B1 抗原模擬表位(NNAAMYSEMATD、FYTSPGRTSHYM、IHQELRYTKDSP、⑶GVHKSHDIRG、TTLQMRSEMADD、SMLNDYRDYTTH、TRDKSSMLERWP)在應用時，可以把合成的模擬表位用于免疫學檢測分析，將通過噬菌體擴增獲得的展示有FB1抗原模擬表位(多肽)的噬菌體粒子直接用于分析檢測，當然，也可以將FB1抗原模擬表位從噬菌體上切下來代替FB1標準品來進行免疫學檢測分析。
[0010]還涉及伏馬菌素B1抗原模擬表位以固相抗原或競爭抗原在免疫學檢測分析中的應用。
[0011]還涉及伏馬菌素B1抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析檢測分析中的應用。
[0012]前述伏馬菌素B1抗原模擬表位可以替換價格昂貴且毒性強的FB1標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于FB1的免疫學檢測，該抗原模擬表位具有與天然FB1分子相似的免疫反應特性，效果非常好。
[0013]本發明的有益效果是:本發明伏馬菌素B1抗原模擬表位可以替換價格昂貴且毒性強的FB1標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于FB1的免疫學檢測，該抗原模擬表位具有與天然FB1分子相似的免疫反應特性，效果非常好。減少了 FB1對人體健康的危害，節約了成本，具有很高的應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為以FBl抗原模擬表位建立的間接競爭ELISA標準曲線。標準曲線的線性回歸方程為 y = -144.51n (X) + 196.18, R2 = 0.9609，IC5tl 值為 0.562ng/mL，線性檢測范圍為 0.171 ?2.420 ng/mL，最低檢測限為 0.121 ng/mL。

【具體實施方式】
[0015]實施例1.FB1抗原模擬表位的親和淘選及其鑒定 I) FB1抗原模擬表位的親和淘選:具體方法為:用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗FB1單克隆抗體，并以終濃度100 yg/mL包被96孔酶標板，4°C孵育過夜。第二天用TBST (50mM NaCl, pH 7.5 包含 0.1% Tween-20 (v/v))洗滌 10 次后，加入 300 μ I 封閉液(3%BSA-PBS) 4°C孵育2小時。2小時后棄封閉液，用TBST洗滌5次，每孔加入100 μ I噬菌體肽庫(噬菌體展示十二肽庫，購自NEB公司，用TBS 10倍稀釋噬菌體原液，約1.0X 111Pfu)，22-26°C振蕩反應I小時。棄去未結合的噬菌體，用TBST洗滌10次，結合上的噬菌體用 0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2)洗脫，并立即用 15 μ I I M Tris-HCl (pH 9.1)中和。取10 μ I洗脫噬菌體測滴度，其余的用于感染20 mL生長至對數前期的疋coli ER2738菌株進行擴增。第三天用PEG/NaCl沉淀純化噬菌體，并測定擴增后噬菌體的滴度。
[0016]在第二、第三輪的淘選過程中，包被的抗FB1單克隆抗體濃度分別為75 yg/mL和50 μ g/mL,所用的TBST濃度為0.25%和0.5%，其余步驟同上。
[0017]2)陽性噬菌體克隆的鑒定:從第三輪淘選后測定噬菌體滴度的平板中隨機挑取20個曬菌體斑,進行曬菌體的擴增,采用間接酶聯免疫吸附檢測方法(Indirect EnzymeLinked immunoasorbent assay, 1-ELISA)進行陽性曬菌體克隆的鑒定,具體方法為:首先，用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗FB1單克隆抗體，10 Pg/mL包被96孔酶標板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進行封閉，37°C孵育I小時；投入100 μ?噬菌體斑擴增液(1.0 X 111 pfu)，以原始噬菌體肽庫作為陰性對照，37 °C孵育I小時；加入1:5000倍稀釋的HRP標記抗M13噬菌體二抗100 μ1，37 °C孵育I小時；加入ΙΟΟμΙ TMB底物液，避光顯色5min，酶標儀(ThermoScientific Multiskan FC)讀取450 nm處的吸收值。選取OD450大于陰性對照2倍的卩遼菌體克隆為陽性克隆。
[0018]3) FB1抗原模擬表位的鑒定:采用間接競爭ELISA的方法進行FB1抗原模擬表位的鑒定，具體方法為:用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗FB1單克隆抗體，10 Pg/mL包被酶標板，4°C孵育過夜；第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進行封閉，37°C孵育I小時；投入50 μ?經間接ELISA鑒定為陽性的噬菌體克隆(1.0XlO11 pfu)和50 μ? FB1標準品(濃度范圍為0_20 ng/ml)，37°C孵育I小時；加入1:5000稀釋HRP標記的抗M13噬菌體二抗100 μ1，37?孵育I小時；加入ΙΟΟμΙTMB底物液，避光顯色5min，讀取OD45tl,能結合抗FB1單克隆抗體，且能被FB1標準品所阻斷的噬菌體，鑒定為FB1的抗原模擬表位。
[0019]實施例2.FB1抗原模擬表位編碼基因的測序及其氨基酸序列的確定
將經過間接競爭ELISA鑒定展示有FBl抗原模擬表位的噬菌體進行擴增，提取噬菌體的DNA測序模板。簡要過程如下:進行噬菌體擴增，在第一步離心后，將800 μ?含噬菌體上清轉入一新離心管。加入200 μ? PEG/NaCl沉淀噬菌體。離心后將沉淀重懸于100 μ?碘化物緩沖液(10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，I mM EDTA, 4 M NaI)，加入 250 μ? 無水乙醇沉淀DNA，離心后再用70%乙醇洗滌沉淀(DNA測序模板)。沉淀最終重懸于20 μ?滅菌水，取2 μ?進行瓊脂糖凝膠電泳分析；取5 PL噬菌體模板進行DNA測序，其-96 gill測序引物為:5’-h°CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。依據DNA測序結果及密碼子表可獲得FB1抗原模擬表位的氨基酸序列。它們的氨基酸序列如下:
NNAAMYSEMATD、FYTSPGRTSHYM、IHQELRYTKDSP、GDGVHKSHDIRG、TTLQMRSEMADD、SMLNDYRDYTTH、TRDKSSMLERffP0
[0020]實施例3.FB1抗原模擬表位作為競爭抗原在ELISA中的應用 (I)樣品提取
稱取5g樣品(谷物及其相關食品)，加入25毫升60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振蕩5分鐘；將提取液用whatman I號濾紙進行過濾后，取I毫升濾液加入4毫升PBS (磷酸鹽緩沖液，PH=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0021](2)包被及封閉
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗FB1單克隆抗體，10 Pg/mL包被酶標板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進行封閉，37 °C孵育I小時后，用PBST洗板6次待用。
[0022]( 3 )標準曲線的建立
取出經步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ?展示有FB1抗原模擬表位的噬菌體(1.0XlO11 pfu)和一系列不同濃度的50 μ? FB1標準品，37°C孵育I小時。加入1:5000稀釋HRP標記的抗Ml3噬菌體二抗，37°C孵育I小時。然后用TMB底物顯色，讀取OD45tl。以FB1濃度對數為橫坐標，結合率(加入FB1的孔的OD45tl/未加入FB1的孔的OD450X 100%)為縱坐標，建立間接競爭標準曲線。結果顯示標準曲線呈S型，線性相關性較好(圖1)。如圖1，以FBl抗原模擬表位(氨基酸序列為NNAAMYSEMATD)建立的間接競爭ELISA標準曲線。標準曲線的線性回歸方程為 y = -144.51n(X) + 196.18，R2 = 0.9609，IC50 值為 0.562ng/mL，線性檢測范圍為0.17Γ2.420 ng/mL，最低檢測限為0.121 ng/mL。
[0023](4)樣品的檢測
取出經步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ?展示有FB1抗原模擬表位的噬菌體(1.0XlO11 pfu)和待測樣品提取液，37°C孵育I小時。加入1:5000稀釋HRP標記的抗M13噬菌體二抗，37°C孵育I小時。然后用TMB底物顯色，讀取0D.，計算結合率，并根據標準曲線，倒推出樣品中含量。
[0024]實施例4.FB1抗原模擬表位作為固相抗原在ELISA中的應用 (I)樣品提取
稱取5g樣品(谷物及其相關食品)，加入25毫升60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振蕩5分鐘；將提取液用whatman I號濾紙進行過濾后，取I毫升濾液加入4毫升PBS (磷酸鹽緩沖液，PH=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0025](2)包被及封閉
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋展示有FB1抗原模擬表位的噬菌體(2.0X 111 pfu), 100微升包被于酶標板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進行封閉，37 °C孵育I小時后，用PBST洗板6次待用。
[0026](3)標準曲線的建立
取出經步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ?抗FB1單克隆抗體(0.5 ng/ml)和一系列不同濃度的50 μ? FB1標準品，37°C孵育I小時。加入1:2000稀釋HRP標記的羊抗鼠IgG 二抗，37°C孵育I小時。然后用TMB底物顯色，讀取0D45(I。以FB1濃度對數為橫坐標，結合率(加入FB1的孔的OD45tl/未加入FB1的孔的OD45tlX 100%)為縱坐標，建立間接競爭標準曲線。
[0027](4)樣品的檢測
取出經步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ?抗FB1單克隆抗體(0.5 ng/ml)和一系列不同濃度的50 μ? FB1標準品，37°C孵育I小時。加入1:2000稀釋HRP標記的羊抗鼠IgG 二抗，37°C孵育I小時。然后用TMB底物顯色，讀取0D45(I。以FB1濃度對數為橫坐標，結合率(加入FB1的孔的OD45tl/未加入FB1的孔的OD45tlX 100%)為縱坐標，建立間接競爭標準曲線。
[0028]實施例5.FBi抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析分析中的應用 (I)樣品提取
稱取5g樣品(谷物及其相關食品)，加入25毫升60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振蕩5分鐘；將提取液用whatman I號濾紙進行過濾后，取I毫升濾液加入4毫升PBS (磷酸鹽緩沖液，PH=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0029](2)噬菌體及控制線的點陣
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋展示有本發明FB1抗原模擬表位的噬菌體(2.0X 111pfu)，用點陣儀或微量移液器將噬菌體劃線于硝酸纖維素膜上(孔徑0.2-0.45微米)，作為檢測線；將0.5 mg/ml的HRP標記的羊抗鼠IgG 二抗，用點陣儀或微量移液劃線于同一張硝酸纖維素膜上(位于檢測線的上方，距離大于5毫米)，作為控制線。
[0030](3 )膠體金標記FB1抗體
將FB1抗體逐滴加入膠體金溶液(pH=8.2)中，邊滴邊攪拌，30分鐘后，取1% PEG加入上述溶液中，繼續攪拌15分鐘后加入十分之一體積的10% BSA溶液，攪拌15分鐘后，靜置30分鐘，離心后去上清，得到膠體金標記的FB1抗體溶液。
[0031](4)膠體金檢測卡的組裝
將膠體金標記的FB1抗體點噴于膠金墊上(1.0微克/毫升)，將樣品墊、膠金墊，點陣了檢測線和控制線的硝酸纖維素膜和吸收紙進行組裝，切成試紙條，裝入檢測卡中待用。
[0032](5)樣品的檢測
將樣品提取液加入樣品墊中，靜置10分鐘，若樣品中含有FB1且超過膠體金檢測試紙的檢測閾值，則檢測線區域不顯色，而控制線區域顯色；若樣品中不含有FB1且低于膠體金檢測試紙的檢測閾值，則檢測線區域顯色，控制線區域也顯色。若控制線區域不顯色，表明試紙條失效。
[0033]實施例5 FB1抗原模擬表位的大量制備
(I)以曬菌體擴增的方式
將展示有FBl抗原模擬表位的噬菌體加入至20 ml接種有ER 2738的培養物中，37度220 rpm振蕩培養4.5 h。將培養物轉入另一離心管中，4 V 10000 rpm離心10 min，將上清的上部80 %轉入一新鮮管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，4 °C下靜置120 min。4°C 10000rpm離心PEG/NaCL靜置溶液15 min。棄上清，短暫離心后吸去殘留上清液。加入ImL TBS進行重懸，即為噬菌體擴增液。
[0034](2)以FB1抗原模擬表位-融合蛋白的方式進行制備
A.PCR擴增FBl抗原模擬表位的外源編碼基因
PCR反應體系:(50 μ? 10 X Pyrobest Buffer (Mg2+ plus)5 M-L
dNTP Mixture (each for 2.5 mM)4 M-L
M13KE insert extens1n primer (10 mM)I M-L
-96 gill sequencing primer (10 mM)I M-L
噬菌體DNA模板I μ?
Pyrobest DNA Polymerase0.5 M-L
滅菌 ddH2037.5 μ?
PCR 反應條件:95°C 5 min，接著 95°C 30 sec, 55°C 30 sec, 72°C 40sec，72°C10 min 共 30 cycles。
[0035]采用PCR產物回收試劑盒純化PCR產物，微量核酸定量儀定量。FBI抗原模擬表位的編碼基因序列分別對應為:
AATAATGCGGCGATGTATTCGGAGATGGCTACTGA、TTTTATACTAGTCCGGGTCGGACGAGTCATTATATG、ATTCATCAGGAGTTGCGTTATACTAAGGATTCTCCG、GGGGATGGGGTGCATAAGTCGCATGATATCCGTGGG、ACTACGCTTCAGATGCGTAGTGAGATGGCTGATGAT、TCGATGCTTAATGATTATCGTGATTATACTACTCAT、ACTCGGGATAAGTCGTCGATGTTGGAGCGTTGGCCG
B.外源編碼基因及表達載體的雙酶切
分別采用ACC65I和Eag I酶對外源編碼基因和表達載體(pMAl-pIII，NEB公司，可表達MBP融合蛋白)進行雙酶切。
[0036]C.酶切后產物的連接及轉化
將質粒pMal-ΡΙΙΙ和目的片段以1: 10(摩爾比)混勻，于16 °C水浴連接12 h,取10 μ L連接產物加至100 μ L感受態細胞TBl中，充分混勻。冰浴30 min后，42 V水浴熱激90 S，立即冰浴5 min后補加600 μ L LB液體培養液，37 °C, 200 rpm培養I h，10000rpm離心2 min,吸去上清留取約200 μ L,涂布于LB-A固體(Ampr)培養基中，37 °C過夜培養，得到陽性克隆。
[0037]D.FB1抗原模擬表位-MBP融合蛋白的表達
將上述獲得的陽性克隆子，從平板上挑一單菌落接種于5 mL LB-A，0.2%蔗糖中，37°C，220 r/min，振蕩培養過夜，將過夜培養物按I %接種量(v/v)接種于50 mL的LB_A，0.2 %蔗糖培養基中，分別接種3瓶，37°C，220 r/min振蕩培養，當培養物細菌濃度0D600達到
0.6時，向三瓶培養物中加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L,220 r/min振蕩培養，將誘導物(PEG溶液)于4 0C, 4000 g，離心20 min收集菌體沉淀，棄上清。重懸細胞于400 mL 30mM Tris-HCl，20%蔗糖，pH 8.0 (80 mL/g細胞濕重)，加入EDTA至I mM，室溫下震蕩5-10min,8000 g,4°C,離心20 min,棄上清,沉淀重懸于400 ml預冷的5 mM MgS04,冰上震蕩10min,8000 g,4°C,離心20 min,保留上清，向上清液中加入8 mL I M Tris-HCl, pH 7.4,獲得FBl抗原模擬表位-MBP融合蛋白。
【權利要求】
1.伏馬菌素8工的十二肽抗原模擬表位，其特征在于氨基酸序列為1^20^11(03？。
2.編碼權利要求1所述十二肽抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸。
3.如權利要求2所述的核苷酸，序列對應為: 1111^1^01^61006661066^06^610^11^1^160
4.權利要求1所述十二肽抗原模擬表位在免疫學檢測分析中的應用。
5.如權利要求4所述應用，其特征在于伏馬菌素8工十二肽抗原模擬表位以固相抗原或競爭抗原在免疫學檢測分析中的應用。
6.如如權利要求4所述應用，其特征在于伏馬菌素8工十二肽抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析檢測分析中的應用。
【文檔編號】G01N33/577GK104356207SQ201410529473
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2013年3月6日 優先權日:2013年3月6日
【發明者】何慶華, 許楊 申請人:南昌大學