一種蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定細菌胞外蛋白酶種類上的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用，包括以下步驟：a.制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酸胺凝膠；b.蛋白酶樣品與不含β-巰基乙醇的加樣緩沖液混勻后加樣，且加樣時樣品不在沸水浴中加熱；c.電泳；d.洗膠；e.將膠在含有不同蛋白酶抑制劑的底物溶液中浸泡；f.反應顯色。本發明方法能對不同蛋白酶進行定性，比傳統方法在耗時上明顯縮短；省去了分離純化蛋白酶的繁瑣步驟；重復性好，靈敏度高，活性條帶測定準確，非常有利于后續的蛋白酶鑒定及有目的的純化工作；可以用于各種蛋白酶類型的檢測，有廣闊的應用空間。
【專利說明】一種蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定細菌胞外蛋白酶種 類上的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于蛋白酶種類鑒定【技術領域】，涉及一種利用蛋白酶譜的活性電泳檢測技 術和蛋白酶抑制劑反應對蛋白酶種類進行快速鑒定的應用方法。
【背景技術】
[0002] 蛋白酶（proteases, proteinases)也稱為肽酶（peptidases)，是一類能水解蛋 白質和多肽水解的酶類，廣泛存在于動物、植物和微生物中，執行許多不同的生理功能。 MER0PS數據庫記錄了蛋白酶及蛋白酶的肽類抑制劑的相關信息，根據催化中心參與催化的 氨基酸的不同，在該數據庫中蛋白酶可分成6大類：天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷 氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和未知催化類型的蛋白酶。蛋白酶 是用途最廣泛的酶制劑之一，占了世界酶類銷售總額的60%，在食品、醫藥、紡織、制革、洗 滌劑、化妝品、動植物蛋白以及廢物處理等行業都有著很好的應用前景。
[0003] 蛋白酶抑制劑（protease inhibitor, PI)是一類分子量較小的多肽或蛋白質，它 們能與蛋白酶活性部位或變構部位結合抑制酶的活性。蛋白酶抑制劑根據其作用于酶的活 性部位的不同，分為絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑（巰基蛋白酶抑制劑）、 金屬羧肽酶蛋白酶抑制劑和天冬氨酸蛋白酶抑制劑。利用蛋白酶抑制劑可以研究蛋白酶活 性中心的催化特性，初步推斷蛋白酶的種類。
[0004] 利用蛋白酶抑制劑檢測蛋白酶的常規方法為，將蛋白酶與抑制劑混合反應后，根 據福林酚法測定其對酪蛋白的酶活。該方法中使用的如果是純酶，則可以直觀的判斷蛋白 酶的類型，但如果是粗酶提取液，結果就不直觀，那是由于粗酶液內含多種蛋白酶，利用該 方法，只能粗略判斷粗酶液中可能含有哪種類型的酶，并不能直觀的看到具體是哪一種或 幾種蛋白酶被抑制。
[0005] 本發明針對上述問題進行了技術改進，利用蛋白酶譜的活性電泳產物通過抑制劑 加底物浸泡的方法解決了上述傳統方法可能的造成的誤差，可有效應用于蛋白酶譜定性的 分析。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種更為快速、準確、簡便的檢測蛋白 酶種類的新方法，應用該方法，可以不用分離純化蛋白酶，不使用昂貴儀器，就可直觀的對 細菌胞外蛋白酶進行分類。大大的縮短了實驗周期，實現對多種蛋白酶譜進行高通量快速 檢測。
[0007] 本發明的目的是通過以下方式實現的：
[0008] 一種蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方法，包括以下步 驟：
[0009] a.制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝膠；
[0010] b.蛋白酶樣品與不含β-巰基乙醇的加樣緩沖液混勻后加樣，且加樣時樣品不在 沸水浴中加熱；
[0011] c.電泳；
[0012] d.洗膠；
[0013] e.將膠放入含有不同蛋白酶抑制劑的底物溶液中浸泡；
[0014] f.反應顯色。
[0015] 步驟a制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝膠的過程如下：配制質量濃度 為 12. 5% 的分離膠：30% w/v 凝膠吧備液 1. 6ml，ρΗ8· 8 的 1. 5mol/L Tris-HCll. 0ml，蒸 餾水1. 4ml，10% w/v過硫酸銨25 μ 1，TEMED2. 5 μ 1 ;混勻后立即將分離膠注入準備好的 玻璃板間隙中，用滴管輕輕在其頂層加入lml蒸餾水，以阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的 抑制作用；聚合完成之后，倒掉覆蓋液體；配制5% w/v的上層濃縮膠：30% w/v凝膠貯備 液0.151111，？冊.8的0.5111〇1/11'1^8-!1(：10.351111，蒸餾水0.51111，10%￥八過硫酸銨2(^1， TEMED2. 0μ 1 ;插入梳子，避免混入氣泡，放置室溫下。
[0016] 步驟b中使用的不含β-巰基乙醇的加樣緩沖液配方為：60mM Tris-HCl ρΗ6. 8、 SDS2%w/v、溴酚藍0· l%w/v、甘油25% ν/ν組成，加樣時樣品和加樣緩沖液的體積比為4 : 1〇
[0017] 4、根據權利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應 用方法，其特征在于，
[0018] 步驟C中電泳緩沖液為ρΗ8. 8的Tris-甘氨酸緩沖液；電泳在冰浴中進行；采用垂 直板式不連續系統電泳方法，5mA穩流進樣后，10mA穩流分離樣品直至溴酚藍指示劑到達 膠的最前沿。
[0019] 步驟d中電泳結束后，用預冷的2. 5% Triton X-100v/v將膠洗三次，每次15min ; 然后用預冷的蒸餾水漂洗數次去除殘留的Triton X-100。
[0020] 步驟e中將膠浸泡在用Tris-HCl緩沖液配制的含有5mM蛋白酶抑制劑和質量濃 度為0.1-2%底物的溶液中，30-401：溫浴1-311。
[0021] 優選將膠浸泡在用pH8. 0的Tris-HCl緩沖液配制的含有5mM蛋白酶抑制劑和質 量濃度為〇. 1%底物的溶液中，37°C溫浴lh后用蒸餾水將膠上殘留的底物沖洗干凈。
[0022] 蛋白酶抑制劑包括苯甲基磺酰氟，1，10-鄰菲啰啉。
[0023] 步驟f的具體過程為：用0. 1 % w/v的考馬斯亮藍R-250染色液染色3h,然后用脫 色液脫色直至透明條帶清晰，其中染色液配方為：lg考馬斯亮藍R-250, 350ml乙醇，100ml 乙酸，加水至l〇〇〇ml ;脫色液配方為：250ml乙醇，100ml乙酸，加水至1000ml。
[0024] 蛋白酶樣品來源于將細菌菌株接種于發酵培養基，在相應培養條件下震蕩培養 3?4天，4°C，13000rpm離心lOmin后得到的上清液，或是其他來源的蛋白酶液。
[0025] 本發明中所用的底物為酪蛋白或明膠。
[0026] 本發明的優點和有益效果
[0027] 1、現有的蛋白酶抑制劑檢測蛋白酶的常規方法是在溶液中將蛋白酶與抑制劑混 合反應后，根據福林酚法測定其對酪蛋白的酶活；但一般檢測的是內含多種蛋白粗酶提取 液，那么在多種蛋白酶的混合溶液中只能粗略判斷粗酶液中可能含有哪種類型的酶，因此 并不能直觀的看到具體是哪一種或幾種蛋白酶被抑制，除非對粗酶提取液進行分離純化， 得到純酶后再進行檢測和鑒定，可想而知，這樣的方法很復雜繁瑣，耗時耗力。本發明將蛋 白酶抑制劑反應與蛋白酶譜的活性電泳檢測技術巧妙的結合在一起，將其應用于蛋白酶種 類的鑒定和檢測；開創性的提出了一種蛋白酶鑒定和檢測的新方法。該方法通過蛋白酶譜 的活性電泳，將不同的蛋白酶分離開，同時不影響蛋白酶自身的活性，然后運用含蛋白酶抑 制劑的底物浸泡方法，讓不同類型的蛋白酶抑制劑分別與蛋白酶作用，通過染色與否判斷 蛋白酶的種類。
[0028] 2、本發明方法能夠對不同蛋白酶進行定性，通過活性電泳將蛋白酶一一分離，讓 它們與抑制劑單獨作用，可以很準確的確認蛋白酶的種類，傳統方法則完全做不到這一點。
[0029] 3、對特定蛋白酶進行定性分析時，本發明省去了分離純化蛋白酶的繁瑣步驟，只 需根據其蛋白酶譜，就可以結論，從而在耗時上比傳統方法大大的縮短了。
[0030] 4、本發明的方法重復性好，靈敏度高，活性條帶測定準確；因為電泳技術已經很成 熟，而且準確性、重復性、靈敏度都是公認的。
[0031] 5、采用本發明方法之后的結果，清晰直觀，一目了然，通過電泳圖片中條帶的染色 與否可以很輕松準確的得出結論。
[0032] 6、本發明的方法可以清晰的辨別細菌分泌的不同的胞外蛋白酶，非常有利于后續 的蛋白酶鑒定及有目的的純化工作。
[0033] 7、本發明的方法還可以用于各種蛋白酶類型的檢測，有廣闊的應用空間。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034] 圖1為本發明方法檢測假交替單胞菌（Pseudoalteromonas sp. SJN2)胞外蛋白酶 液加入不同抑制劑后的電泳染色圖譜；
[0035] 圖2為本發明方法檢測枯草桿菌Bacillus sp. SQN6-1胞外蛋白酶液加入不同抑 制劑后活性電泳圖譜的比較；
[0036] 圖3為本發明方法檢測胰蛋白酶液加入不同抑制劑后活性電泳圖譜的比較；
[0037] 圖4為本發明方法檢測膠原蛋白酶液加入不同抑制劑后活性電泳圖譜的比較；
[0038] 圖5為蛋白酶抑制劑的不同濃度的電泳染色圖譜；
[0039] 由圖5可知，蛋白酶抑制劑濃度為5mM時效果最好。
【具體實施方式】
[0040] 下面結合實施例對本發明的技術方案作進一步說明，但本發明所保護范圍不限于 此。
[0041] 本發明使用的試劑：丙稀酰胺、Ν，Ν' -甲叉雙丙稀酰胺、SDS、過硫酸銨（Sigma)， Tris(Sigma進口分裝），甘氨酸（Sigma進口分裝），酪蛋白、明膠（Sigma進口分裝）， 0P (1，10-鄰菲羅啉，Aladdin)，PMSF (苯甲基磺酰氟，Sigma)，其他試劑均為普通市售產品。
[0042] 實施例1 :采用本發明方法檢測海洋假交替單胞菌（Pseudoalteromonas sp. SJN2)胞外蛋白酶。海洋假交替單胞菌（Pseudoalteromonas sp. SJN2)為本實驗室分離 自海口假日海灘潮間帶海沙的菌株。
[0043] 步驟如下：
[0044] (1)將假交替單胞菌劃線接種于固體培養基，在18°C條件下活化培養48h，然后接 種于5ml液體LB培養基中，在18°C、200rpm的條件下震蕩培養24h，然后按5% (v/v)的接 種量接種于l〇〇ml的發酵培養基中，在18°C、200rpm的條件下震蕩培養4天，lOOOOrpm離 心，制得發酵液；
[0045] 上述固體培養基組分如下，均為重量份：
[0046] 蛋白胨1份，酵母粉0. 5份、1. 5份瓊脂，蒸餾水100份，pH為7. 5?8. 0 ;
[0047] LB培養基組分如下，均為重量份：
[0048] 蛋白胨1份，酵母粉0. 5份，蒸餾水100份，pH為7. 5?8. 0 ;
[0049] 發酵培養基組分如下，均為重量份：玉米粉1分，麩皮0. 5份，豆柏1份，Na2HP040. 4 份，ΚΗ2Ρ040· 03 份，CaCl20. 1 份，蒸餾水 100 份，ρΗ7· 5。
[0050] (2)將步驟⑴制得的發酵液在4°C條件下，lOOOOrpm離心lOmin，取上清，制得胞 外酶液；4°C冰箱保存待用。
[0051] (3)配制 12.5 % 分離膠：30 % 凝膠貯備液 1.6ml，1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)1.0ml，蒸餾水1.4ml，10%過硫酸銨25μl，TEMED2.5μl。混勻后立即小 心的將分離膠注入準備好的玻璃板間隙中，用滴管輕輕在其頂層加入lml蒸餾水，以阻止 空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。聚合完成之后，倒掉覆蓋液體。配制5%上層濃縮 膠：30%凝膠貯備液 0. 15ml，pH6. 8 的 0. 5mol/L Tris-HClO. 35ml，蒸餾水 0. 5ml，10%過硫 酸銨20 μ 1，TEMED2. 0 μ 1 ;插入梳子，小心避免混入氣泡，放置室溫下。
[0052] (4)將步驟⑵制得的胞外酶液20 μ 1與5 μ 1加樣緩沖液（使用的加樣緩沖液配 方為：60mMTris-HCl pH6. 8、SDS2%、溴酚藍0. 1%、甘油25%組成）混勻，樣品不在沸水浴 中加熱。電泳采用垂直板式不連續系統電泳方法，在Mini PR0TAIN3小型垂直電泳槽和蛋 白質電泳儀電泳儀上進行。在冰浴中穩壓120V電泳，分離樣品直至溴酚藍指示劑到達膠的 最前沿。
[0053] (5)電泳結束后，將步驟⑷得到的電泳凝膠用預冷的Triton X-100 (2. 5% )洗 三次，每次15min。然后用預冷的蒸饋水漂洗數次去除殘留的Triton X-100。
[0054] (6)將步驟（5)清洗好的膠浸泡在用pH8. 0的Tris-HCl緩沖液配制的含有0. 2% 底物以及終濃度為5mM的蛋白酶抑制劑的溶液中，37°C恒溫震蕩浸泡lh，然后用蒸餾水將 膠上殘留的底物沖洗干凈，用0.1% (w/v)的考馬斯亮藍R-250染色液染色3h，然后用脫色 液脫色直至透明條帶清晰。其中染色液配方為：lg考馬斯亮藍R-250, 350ml乙醇，100ml乙 酸，加水至l〇〇〇ml ;脫色液配方為：250ml乙醇，100ml乙酸，加水至1000ml。酶譜條帶如 圖1所示。0P特異性結合二價金屬離子，可以抑制金屬蛋白酶活性，PMSF為絲氨酸蛋白酶 抑制劑，所以可以從圖1中清楚的看出，其中5條為絲氨酸蛋白酶條帶，因為加入PMSF后其 活性條帶消失，有4條為金屬蛋白酶，在含有0P的活性電泳圖譜上降解帶消失，說明被0P 強烈的抑制了，喪失了酶活性。
[0055] 實施例2 :采用本發明的方法檢測海洋細菌（Bacillus sp. SQN6-1)胞外蛋白酶的 各操作步驟同實施例1，發酵培養時間為72小時。海洋Bacillus sp. SQN6-1為本實驗室分 離自海口假日海灘海水的菌株。步驟同實施例1。蛋白酶譜條帶如圖2所示。0P特異性結 合二價金屬離子，可以抑制金屬蛋白酶活性，PMSF為絲氨酸蛋白酶抑制劑，所以可以從圖2 中清楚的看出，其中3條為絲氨酸蛋白酶條帶，因為加入PMSF后其活性條帶消失，有1條為 金屬蛋白酶，在含有0P的活性電泳圖譜上降解帶消失，說明被0P強烈的抑制了，喪失了酶 活性。
[0056] 實施例3 :采用本發明的方法檢測胰蛋白酶Trypsin的各操作步驟同實施例1，所 不同的是采用購買的上海生工的商品酶制劑，胰蛋白酶Trypsin,本實驗目的是建立實驗方 法，胰蛋白酶是典型的絲氨酸蛋白酶，能夠被PMSF抑制劑抑制，但是抑制劑0P對其酶活并 沒有影響。胰蛋白酶譜條帶如圖3所示。胰蛋白酶為典型的絲氨酸蛋白酶，底物溶液加入 PMSF，保溫孵育后其活性條帶完全消失，而在含有0P的活性電泳圖譜上降解帶沒有變化。
[0057] 實施例4 :采用本發明的方法檢測膠原蛋白酶Collagenase蛋白酶的各操作 步驟同實施例1，所不同的是采用購買的Invitrogen公司的商品酶制劑，膠原蛋白酶 Collagenase,本實驗目的是建立實驗方法，膠原蛋白酶是典型的金屬蛋白酶，能夠被0P抑 制劑抑制，但是抑制劑PMSF對其酶活并沒有影響。膠原蛋白酶譜條帶如圖4所示。膠原蛋 白酶為典型的金屬蛋白酶，底物溶液加入PMSF，保溫孵育后其活性條帶基本沒有變化，而在 含有0P的活性電泳圖譜上降解帶完全消失，說明膠原蛋白酶的活性被0P所抑制。
【權利要求】
1. 一種蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方法，其特征在于，包 括以下步驟： a. 制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝膠； b. 蛋白酶樣品與不含β_巰基乙醇的加樣緩沖液混勻后加樣，且加樣時樣品不在沸水 浴中加熱； c. 電泳； d. 洗膠； e. 將膠放入含有不同蛋白酶抑制劑的底物溶液中浸泡； f. 反應顯色。
2. 根據權利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方 法，其特征在于， 步驟a制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝膠的過程如下：配制質量濃度為 12. 5% 的分離膠：30% w/v 凝膠吧備液 1. 6ml，ρΗ8· 8 的 1. 5mol/L Tris-HCll. Oml，蒸饋 水1. 4ml，10% w/v過硫酸銨25 μ 1，TEMED2. 5 μ 1 ;混勻后立即將分離膠注入準備好的玻 璃板間隙中，用滴管輕輕在其頂層加入lml蒸餾水，以阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑 制作用；聚合完成之后，倒掉覆蓋液體；配制5 % w/v的上層濃縮膠：30% w/v凝膠貯備 液 0· 15ml，ρΗ6· 8 的 0· 5mol/L Tris-HClO. 35ml，蒸餾水 0· 5ml，10% w/v 過硫酸銨 20μ 1， TEMED2. 0μ 1 ;插入梳子，避免混入氣泡，放置室溫下。
3. 根據權利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方 法，其特征在于， 步驟b中使用的不含β-巰基乙醇的加樣緩沖液配方為：60mM Tris-HCl ρΗ6.8、 SDS2%w/v、溴酚藍0· l%w/v、甘油25% v/v組成，加樣時樣品和加樣緩沖液的體積比為4 : 1〇
4. 根據權利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方 法，其特征在于， 步驟c中電泳緩沖液為pH8. 8的Tris-甘氨酸緩沖液；電泳在冰浴中進行；采用垂直板 式不連續系統電泳方法，5mA穩流進樣后，10mA穩流分離樣品直至溴酚藍指示劑到達膠的 最前沿。
5. 根據權利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方 法，其特征在于， 步驟d中電泳結束后，用預冷的2. 5% Triton X-lOOv/v將膠洗三次，每次15min ;然后 用預冷的蒸餾水漂洗數次去除殘留的Triton X-100。
6. 根據權利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方 法，其特征在于， 步驟e中將膠浸泡在用Tris-HCl緩沖液配制的含有5mM蛋白酶抑制劑和質量濃度為 0.1-2%底物的溶液中，30-401：溫浴1-311。
7. 根據權利要求6所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方 法，其特征在于， 將膠浸泡在用PH8. 0的Tris-HCl緩沖液配制的含有5mM蛋白酶抑制劑和質量濃度為 0. 1 %底物的溶液中，37°c溫浴lh后用蒸餾水將膠上殘留的底物沖洗干凈。
8. 根據權利要求1或6或7所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的 應用方法，其特征在于，蛋白酶抑制劑包括苯甲基磺酰氟，1，10-鄰菲啰啉或EDTA。
9. 根據權利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方 法，其特征在于， 步驟f的具體過程為：用〇. 1 % w/v的考馬斯亮藍R-250染色液染色3h，然后用脫色液 脫色直至透明條帶清晰，其中染色液配方為：lg考馬斯亮藍R_250,350ml乙醇，100ml乙酸， 加水至l〇〇〇ml ;脫色液配方為：250ml乙醇，100ml乙酸，加水至1000ml。
10. 根據權利要求1所述的蛋白酶譜電泳檢測方法在快速鑒定蛋白酶種類上的應用方 法，其特征在于，蛋白酶樣品來源于將細菌菌株接種于發酵培養基，在相應培養條件下震蕩 培養3?4天，4°C，13000rpm離心lOmin后得到的上清液，或是其他來源的蛋白酶液。
【文檔編號】G01N27/447GK104122317SQ201410309658
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月1日 優先權日:2014年7月1日
【發明者】何海倫, 劉丹, 武翠玲, 楊興昊, 吳日幫, 黃嘉封, 黃雅雯 申請人:中南大學
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