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高靈敏食物過敏原檢測方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高靈敏食物過敏原檢測方法及其試劑盒。1）食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠，所述的食物過敏原包括但不限于水產(chǎn)類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白；2）構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：梯度稀釋抗食物過敏原的IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)品與食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠進行免疫反應(yīng)，然后利用抗人IgG二抗進行信號放大反應(yīng)，根據(jù)平均吸光度值和相應(yīng)的濃度進行線性回歸，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線；3）篩查食物過敏原，利用食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠與過敏患者的血清進行免疫反應(yīng)，然后利用抗人IgG二抗進行信號放大反應(yīng)，然后確定食物過敏原的種類及對應(yīng)的抗體的濃度。本發(fā)明靈敏度范圍不高于2pg/mL，可適用于轉(zhuǎn)基因食品的過敏原檢測。
【專利說明】高靈敏食物過敏原檢測方法及其試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食物安全及過敏檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種高靈敏食物過敏原檢測方法及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]過敏性疾病影響全世界近四分之一的人口，被世界衛(wèi)生組織列為21世紀重點防治的三大疾病之一。食物過敏醫(yī)學(xué)上也稱變態(tài)反應(yīng)，是指機體受抗原(包括半抗原)刺激后，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細胞，當(dāng)再次接觸同一種抗原后在體內(nèi)引起體液或細胞免疫反應(yīng)，由此導(dǎo)致組織損傷或機體生理機能障礙。它是一種復(fù)發(fā)率很高的疾病。據(jù)食品過敏或過敏性反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)統(tǒng)計，約有90%的過敏反應(yīng)是由花生、果仁、魚、貝類、雞蛋、牛奶、大豆、魚蝦、蘑菇和小麥等食物引起(以花生引起的過敏最為嚴重)，10%的過敏是由170多種其他食物引起。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，近年來過敏癥發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。據(jù)調(diào)查西方大概有20-25%的人受過過敏原的襲擾，我國大約有5-10%的人受過敏原的襲擾。上海、浙江、廣東等沿海地區(qū)收過敏原襲擾的人群已超過10%，隨著工業(yè)的快速發(fā)展，生活水平的提高，飲食的改善，受過敏原襲擾的人群每年以1.5%的速度增加。美國每年約有29T2.5%的人發(fā)生食物過敏，兒童及嬰幼兒的發(fā)病率約59T8%。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國的發(fā)病率高于發(fā)達國家。目前，隨著科技進步和經(jīng)濟的發(fā)展，產(chǎn)生了諸多新的食品資源，以及食品生產(chǎn)、流通、消費方式的改變，傳統(tǒng)的食物過敏的地域性打破，并且隨著轉(zhuǎn)基因作物的大量出現(xiàn)，許多新的轉(zhuǎn)基因食品大量涌現(xiàn)，也使得食物過敏更具備了潛在的危險性。食物過敏在相當(dāng)大的程度上危害著過敏人群的健康，保護消費者食品安全已經(jīng)成為食品安全管理部門及食品生產(chǎn)企業(yè)所面臨的重要問題。
[0003]許多人在直接或者間接接觸這些過敏原之后，會因過敏而患上支氣管哮喘、上呼吸道結(jié)膜炎、濕疹、皮炎等癥，有時甚至產(chǎn)生危及生命的過敏性休克。因此迫切需要從眾多食物中篩查出隱藏的過敏原，讓易敏者避開含有致敏成分的食物以及治療過敏反應(yīng)，同時排除類似過敏癥狀慢性疾病的誤診。過敏患者由于攝入引發(fā)過敏反應(yīng)的食物過敏原蛋白后，體內(nèi)嗜堿粒細胞和肥大細胞脫顆粒化引起特異性的IgG沉淀抗體進入血液，使血液中這種特異性IgG抗體水平提高。該特異性IgG抗體在體外能識別其對應(yīng)的抗原，即食物過敏原蛋白，并與之結(jié)合。
[0004]對于過敏原性的檢測，體內(nèi)實驗方法可提供最為直接的證據(jù)，如雙盲食物激發(fā)試驗和皮膚針刺試驗，但由于安全因素等方面的考慮，只有在不得已的情況下在醫(yī)院進行，而且費用昂貴、風(fēng)險大；與此相比體外實驗方法具有方便、安全的優(yōu)點，但卻存在著準(zhǔn)確性差的缺點。隨著科技的發(fā)展，未來食品過敏原檢測將向準(zhǔn)確、安全、經(jīng)濟、快速、高通量、高靈敏度的體外檢測技術(shù)方向發(fā)展。
[0005]食物過敏原診斷試劑的種類很多，影響試劑質(zhì)量的因素也很多，為保證試劑質(zhì)量需要盡可能的提高技術(shù)指標(biāo)。靈敏度作為一項重要的技術(shù)指標(biāo)，對試劑盒的評價具有重要的意義。因為極少量的分析物可能對界定疾病狀態(tài)、疾病篩查有重要意義。在食物過敏原檢測中體內(nèi)產(chǎn)生的抗體是十分微量的，而市場上現(xiàn)有技術(shù)大多只能達到納克級，在檢測低于此濃度時就變得比較困難，而難以達到預(yù)期目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種高靈敏食物過敏原檢測方法及其試劑盒。
[0007]一種高靈敏食物過敏原檢測方法，步驟如下:
1)食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠，所述的食物過敏原包括但不限于水產(chǎn)類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白；
2)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線:梯度稀釋抗食物過敏原的IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)品與食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠進行免疫反應(yīng)，然后利用抗人IgG 二抗進行信號放大反應(yīng)，根據(jù)平均吸光度值和相應(yīng)的濃度進行線性回歸，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線；
3)篩查食物過敏原，利用食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠與過敏患者的血清進行免疫反應(yīng)，然后利用抗人IgG 二抗進行信號放大反應(yīng)，然后根據(jù)得到的信號與步驟2)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定食物過敏原的種類及對應(yīng)的抗體的濃度。
[0008]所述的信號放大反應(yīng)為顯色反應(yīng)。
[0009]所述的步驟3)中確定食物過敏原的種類的cut-off值設(shè)定為抗體濃度Ing/mL的值在標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的吸光度值。
[0010]所述的步驟I)中，具體方法如下: 1.1)取一只5mL的離心管向其中分別加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸鹽緩沖液、ImL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和IOOuL 100mg/mL的NHS溶液，把離心管置于搖床上，室溫條件下活化30min ；
1.2)將離心管置于磁力架上吸住磁珠，棄掉清液，并向離心管中加入5mL50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液；重復(fù)洗滌3次，最后一次加入4.499 mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液；
1.3)再向其中加入5ug/mL的食物過敏原蛋白500uL，1%牛血清蛋白luL，把離心管置于搖床上，40 °C條件下反應(yīng)45min ；
1.4)重復(fù)1.2)的洗滌步驟；
1.5)加入4.9901^ 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液與IOuL 1%BSA溶液，4°C條件下封閉保
存待用。
[0011]所述的步驟3)中，具體方法如下:
3.1)取若干只2mL的離心管，分別加入300uL偶聯(lián)食物過敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，棄掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸鹽緩沖液，如此洗滌3次。最后吸干；
3.2)向洗滌后的磁珠中加入120uL，含20%甘油，梯度稀釋的抗體，室溫條件下孵育40min ；
3.3)孵育結(jié)束后，用磁力架吸住磁珠，棄掉清液，再加入300uL的PBS洗滌液，漩渦震蕩，再用磁力架吸住磁珠，如此洗滌5次，最后吸干液體；
3.4)向洗滌后的磁珠中加入100ng/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗120uL，含20%甘油，室溫條件下孵育40min ；
3.5)重復(fù)步驟3.3)； 3.6)向洗滌后的磁珠中加入IOOuL的TMB顯色液，避光反應(yīng)15min ；
3.7)避光反應(yīng)后，向其中加入IOOuL ImoL/L的鹽酸溶液，終止反應(yīng)，并把液體轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板上；
3.8)用酶標(biāo)儀讀取吸光度值；
3.9)結(jié)果計算。
[0012]所述的磁珠的表面具有羧基、氨基或者無基團,粒徑大小在100nnT3um。
[0013]食物過敏原檢測試劑盒，它包括但不限于已包被的水產(chǎn)類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白中的一種或多種的磁性納米微球、人IgG標(biāo)準(zhǔn)液、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗、TMB、樣品稀釋液、洗滌液和終止液，靈敏度范圍不高于2pg/mL。
[0014]所述的試劑盒，適用于轉(zhuǎn)基因食品的過敏原檢測。
[0015]本發(fā)明的有益效果:將磁珠作為固相載體，來代替ELISA檢測中的酶標(biāo)板微孔。此固相載體相比于普通ELISA的酶標(biāo)板微孔擁有更大的表面負載量，并且可以對目標(biāo)物質(zhì)具有更強的富集作用，通過外加磁場和洗滌的過程可以對目標(biāo)物起到一個濃縮的作用，最終提高食物過敏原檢測的靈敏度、準(zhǔn)確性和線性范圍。靈敏度范圍不高于2pg/mL，可適用于轉(zhuǎn)基因食品的過敏原檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是實施例四中試劑線性實驗的結(jié)果示意圖；
圖2是實施例試劑線性實驗的結(jié)果示意圖。
【具體實施方式】
[0017]以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步的說明。
[0018]本發(fā)明的食物過敏原檢測試劑盒，其組成包括已包被的水產(chǎn)類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白的磁性納米微球，人IgG標(biāo)準(zhǔn)液、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，TMB，樣品稀釋液，洗滌液和終止液。
[0019]1、食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠
①取一只5mL的離心管向其中分別加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸鹽緩沖液、ImL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和IOOuL 100mg/mL的NHS溶液，把離心管置于搖床上，室溫條件下活化30min。
[0020]②將離心管置于磁力架上吸住磁珠，棄掉清液，并向離心管中加入5mL 50mMpH6.5的磷酸鹽緩沖液；如此重復(fù)洗滌3次，最后一次加入4.499mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液。
[0021]③再向其中加入5ug/mL的食物過敏原蛋白500uL，l%牛血清蛋白luL，把離心管置于搖床上，40°C條件下反應(yīng)45min。
[0022]④重復(fù)②的洗滌步驟。
[0023]⑤加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液與IOuL 1%BSA溶液，4°C條件下封閉保存。待用。
[0024]2、食物過敏原檢測試劑盒的使用方法①取若干只2mL的離心管，分別加入300uL偶聯(lián)食物過敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，棄掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸鹽緩沖液，如此洗滌3次。最后吸干。
[0025]②向洗滌后的磁珠中加入120uL (含20%甘油)梯度稀釋的抗體,室溫條件下孵育 40min。
[0026]③孵育結(jié)束后，用磁力架吸住磁珠，棄掉清液，再加入300uL的PBS洗滌液，漩渦震蕩，再用磁力架吸住磁珠，如此洗滌5次，最后吸干液體。
[0027]④向洗滌后的磁珠中加入100ng/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗120uL (含20%甘油)，室溫條件下孵育40min。
[0028]⑤重復(fù)步驟③。
[0029]⑥向洗滌后的磁珠中加入1OOuL的TMB顯色液，避光反應(yīng)15min。
[0030]⑦避光反應(yīng)后，向其中加入IOOuL ImoL/L的鹽酸溶液，終止反應(yīng)。并把液體轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板上。
[0031]⑧用酶標(biāo)儀讀取吸光度值。
[0032]⑨結(jié)果計算 取重復(fù)孔平行三次的吸光度平均值；以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值和相應(yīng)的濃度進行線性回歸，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線；計算樣品重復(fù)孔的平均吸光度值大于CUt-Off值(Ing/mL對應(yīng)的吸光度)的那個吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出食物過敏原抗體的含量，此含量反應(yīng)了患者的過敏程度。
[0033]實施例一
I對蝦過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠
①取一只5mL的離心管向其中分別加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸鹽緩沖液、ImL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和IOOuL 100mg/mL的NHS溶液，把離心管置于搖床上，室溫條件下活化30min。
[0034]②將離心管置于磁力架上吸住磁珠，棄掉清液，并向離心管中加入5mL 50mMpH6.5的磷酸鹽緩沖液；如此重復(fù)洗滌3次，最后一次加入4.499mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液。
[0035]③再向其中加入5ug/mL的對奸過敏原蛋白500uL (對奸過敏原是一種相對分子質(zhì)量約36Kd的酸性糖蛋白，屬肌肉中的原肌球蛋白。蛋白濃度1.5mg/mL，溶于PBS，效價≥1:1000-5000。)，1%牛血清蛋白luL，把離心管置于搖床上，40°C條件下反應(yīng)45min。
[0036]④重復(fù)②的洗滌步驟。
[0037]⑤加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液與IOuL 1%BSA溶液，4°C條件下封閉保存。待用。
[0038]2對蝦過敏原抗體的檢測方法
①取3只2mL的離心管，分別加入300uL偶聯(lián)對蝦過敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，棄掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸鹽緩沖液，如此洗滌3次。最后吸干。
[0039]②向洗滌后的磁珠中加入120uL (含20%甘油)的小鼠抗對蝦過敏原蛋白單克隆抗體(溶于 PBS，pH7.4 中，蛋白濃度 lmg/mL，含 BSA 等穩(wěn)定劑，ELISA(1:500)，IHC(1:200)，IP (1:50), WB (1:300)。)，室溫條件下孵育 40min。
[0040]③孵育結(jié)束后，用磁力架吸住磁珠，棄掉清液，再加入300uL的PBS洗滌液，漩渦震蕩，再用磁力架吸住磁珠，如此洗滌5次，最后吸干液體。
[0041]④向洗滌后的磁珠中加入100ng/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗120uL (含20%甘油)，室溫條件下孵育40min。
[0042]⑤重復(fù)步驟③。
[0043]⑥向洗滌后的磁珠中加入IOOuL的TMB顯色液，避光反應(yīng)15min。
[0044]⑦避光反應(yīng)后，向其中加入IOOuL ImoL/L的鹽酸溶液，終止反應(yīng)。并把液體轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板上。
[0045]⑧用酶標(biāo)儀讀取吸光度值。
[0046]⑨結(jié)果計算
取重復(fù)孔平行三次的吸光度平均值；以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值和相應(yīng)的濃度進行線性回歸，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線；計算樣品重復(fù)孔的平均吸光度值大于CUt-Off值(Ing/mL對應(yīng)的吸光度)的那個吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出對蝦過敏原抗體的含量。特異性達91.3%。
[0047]實施例二:食物過敏原篩查試驗
對35例食物過敏患者抽取血液，將其制備血清，來篩查食物過敏原。檢測吸光度值，計算抗體濃度，其中值大于cut-off值(Ing/mL對應(yīng)的吸光度)的判斷為陽性。其檢測結(jié)果如下表1所示:
表1
【權(quán)利要求】
1.一種高靈敏食物過敏原檢測方法，其特征在于，步驟如下: 1)食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠，所述的食物過敏原包括但不限于水產(chǎn)類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白； 2)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線:梯度稀釋抗食物過敏原的IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)品與食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠進行免疫反應(yīng)，然后利用抗人1gG 二抗進行信號放大反應(yīng)，根據(jù)平均吸光度值和相應(yīng)的濃度進行線性回歸，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線； 3)篩查食物過敏原，利用食物過敏原蛋白偶聯(lián)磁珠與過敏患者的血清進行免疫反應(yīng)，然后利用抗人1gG 二抗進行信號放大反應(yīng)，然后根據(jù)得到的信號與步驟2)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定食物過敏原的種類及對應(yīng)的抗體的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的信號放大反應(yīng)為顯色反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步驟3)中確定食物過敏原的種類的cut-off值設(shè)定為抗體濃度1ng/mL的值在標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的吸光度值。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟1)中，具體方法如下: .1.1)取一只5mL的離心管向其中分別加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸鹽緩沖液、1mL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和1OOuL 100mg/mL的NHS溶液，把離心管置于搖床上，室溫條件下活化30min ； .1.2)將離心管置于磁力架上吸住磁珠，棄掉清液，并向離心管中加入5mL50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液；重復(fù)洗滌3次，最后一次加入4.499 mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液； .1.3)再向其中加入5ug/mL的食物過敏原蛋白500uL，1%牛血清蛋白luL，把離心管置于搖床上，40 °C條件下反應(yīng)45min ； .1.4)重復(fù)1.2)的洗滌步驟； .1.5)加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液與1OuL 1%BSA溶液，4°C條件下封閉保存待用。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步驟3)中，具體方法如下: .3.1)取若干只2mL的離心管，分別加入300uL偶聯(lián)食物過敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，棄掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸鹽緩沖液，如此洗滌3次； 最后吸干； .3.2)向洗滌后的磁珠中加入120uL，含20%甘油，梯度稀釋的抗體，室溫條件下孵育40min ； .3.3)孵育結(jié)束后，用磁力架吸住磁珠，棄掉清液，再加入300uL的PBS洗滌液，漩渦震蕩，再用磁力架吸住磁珠，如此洗滌5次，最后吸干液體； .3.4)向洗滌后的磁珠中加入100ng/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗120uL，含20%甘油，室溫條件下孵育40min ； .3.5)重復(fù)步驟3.3)； .3.6)向洗滌后的磁珠中加入1OOuL的TMB顯色液，避光反應(yīng)15min ； .3.7)避光反應(yīng)后，向其中加入1OOuL 1moL/L的鹽酸溶液，終止反應(yīng)，并把液體轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板上； .3.8)用酶標(biāo)儀讀取吸光度值； .3.9)結(jié)果計算。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁珠的表面具有羧基、氨基或者無基團，粒徑大小在100nnT3um。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法的食物過敏原檢測試劑盒，其特征在于，它包括但不限于已包被的水產(chǎn)類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白中的一種或多種的磁性納米微球、人IgG標(biāo)準(zhǔn)液、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗、TMB、樣品稀釋液、洗滌液和終止液，靈敏度范圍不高于2pg/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要 求7所述的試劑盒，其特征在于，適用于轉(zhuǎn)基因食品的過敏原檢測。
【文檔編號】G01N33/68GK103616520SQ201310645509
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】沈曉亮, 錢兵, 劉意, 宋偉杰, 方序, 葉俊英, 董婧 申請人:浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司, 杭州賽恩生物技術(shù)有限公司