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專利名稱：一種草莓類胡蘿卜素成分的含量測定方法
一種草莓類胡蘿卜素成分的含量測定方法
技術領域：
本發明涉及一種草莓類胡蘿卜素成分的含量測定方法。
背景技術：
草莓(Fragaria ananassa Duch)屬薔薇科多年生草本植物,果實鮮美紅嫩,濃郁多汁，果味芳香并且營養豐富，素有“水果皇后”之稱。近年來，隨著草莓經濟價值的日益走俏，人們開始越來越重視草莓的果實品質。類胡蘿卜素(Carotenoids)既是決定水果、蔬菜內在營養品質的重要指標，也是影響果實外觀品質和花卉觀賞價值的重要因素。越來越多的醫學研究表明，除了不少類胡蘿卜素是維生素A的前體外，許多類胡蘿卜素在猝滅自由基、增強人體免疫力、預防心血管疾病和防癌抗癌等保護人類健康方面起著重要的作用。目前草莓類胡蘿卜素提取和測定尚未見報道，缺少準確可靠的檢測方法，因此建立一種快速、準確的測定方法對研究草莓果實類胡蘿卜素積累規律、合理開發和利用我國草莓資源具有重要的理論價值和應用前景。檢測植物中類胡蘿卜素的方法有紙層析法、柱層析法、薄層層析法、膜層析法和高效液相色譜法。超高效液相色譜(Ultra performance liquid chromatography, UPLC)是近幾年推出的一種新的液相色譜技術，相較于傳統的分析方法帶來的分辨率限制、操作繁雜、無法檢測到更多種類的類胡蘿卜素的缺點，UPLC以更短的填料色譜柱，耐受超高壓(40mpa)色譜泵和色譜系統，使分離速度、靈敏度、分離度達到普通HPLC的9、3、1.7倍，體現出明顯的超高選擇性、超高分離度、超高靈敏度以及超高速等優勢，在蛋白組學、代謝組學、天然產物、環境監測等眾多高端領域得到應用。利用UPLC測定草莓類胡蘿卜素含量國內外還未見報道。

發明內容
本發明要解決的技術問題，在于提供一種草莓類胡蘿卜素成分的含量測定方法，該測定方法簡單快速，結果準確可靠。本發明是這樣實現的:一種草莓類胡蘿卜素成分的含量測定方法，采用超高效液相色譜法在同一色譜條件下對草莓果實中的4種分別為葉黃素、β-胡蘿卜素、隱黃質以及番茄紅素的類胡蘿
卜素成分同時進行含量測定；該方法包括如下步驟:(I)制備對照品溶液:分別稱取葉黃素、β -胡蘿卜素、β -隱黃質、番茄紅素對照品，加丙酮得到四種單個對照品溶液；再分別精密量取四種單個對照品溶液，置同一容量瓶中，得到混合對照品溶液；(2)制備供試品溶液:精密稱定草莓果肉，用液氮快速研磨至粉末狀，置具塞錐形瓶中，精密加入丙酮:石油醚=1:2提取劑，于50°C下，避光浸提3小時，過濾出上清液；殘渣反復浸提至殘渣發白，合并上清液，用旋轉蒸發儀40°C蒸至糊狀；加入石油醚和10%K0H-甲醇，避光，室溫萃取，阜化過夜；然后過濾，將濾液轉入250ml分液漏斗中，并將分液漏斗下層的皂化液轉入錐形瓶，用石油醚反復萃取皂化液至石油醚層為無色，接著合并石油醚層至另一 250ml分液漏斗中，用雙蒸水反復洗滌石油醚層，去殘余的丙酮至雙蒸水層為中性，繼續加入無水硫酸鈉脫水后旋轉蒸發儀40°C蒸干，最后用丙酮定容，即得；(3)制定色譜條件:儀器:WATERSACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜；色譜柱:ACQUITYUPLC BEH C18 規格為 2.1mmX50mm, 1.7u m 的色譜柱；流動相:乙腈與甲醇；流動相流速:0.5ml/min ;檢測波長:450nm；進樣體積:5ul ;柱溫:27O;(4)進行常規系統適應性試驗，注入超高效液相色譜儀進行葉黃素、β -胡蘿卜素、β-隱黃質以及番茄紅素含量測定。進一步地，流動相各組分的體積比為乙腈:甲醇=9:1。進一步地，步驟(I)對照品溶液的制備為:分別精密稱取葉黃素、胡蘿卜素、β -隱黃質、番爺紅素對照品各1.0mg,加丙酮定容于5ml容量瓶中，得到濃度為200ug/ml單個對照品溶液；分別精密量取單個對照品溶液，置同一容量瓶，得到混合對照品溶液。進一步地，步驟(2)中加入的丙酮、石油醚以及10%K0H_甲醇中均含0.1%BHT。本發明具有如下優點:本發明確定了適用于草莓類胡蘿卜素成分測定的超高效液相法，本方法精密度高、靈敏度強、重復性好、回收率高，本發明的流動相組合可以將4種類胡蘿卜素成分徹底分離，且在同一色譜條件下對草莓中4種類胡蘿卜素成分同時進行分離和含量測定，流動相試劑用量少，方法簡單快速，結果準確可靠，在5分鐘內就可完成檢測，大大提高了分析速度和減少了溶劑消耗；本發明方法采用皂化處理工藝步驟，可以提高草莓果實中類胡蘿
卜素提取效果，因此本發明是適合草莓果實類胡蘿卜素定性和定量分析的最佳方法，為草莓果實類胡蘿卜素研究提供技術基礎。

下面參照附圖結合實施例對本發明`作進一步的說明。圖1為葉黃素對照品溶液超高效液相色譜(UPLC)圖。圖2為β -胡蘿卜素對照品溶液超高效液相色譜(UPLC)圖。圖3為β -隱黃質對照品溶液超高效液相色譜(UPLC)圖。圖4為番茄紅素對照品溶液超高效液相色譜(UPLC)圖。圖5為葉黃素、β -隱黃質、番茄紅素、β -胡蘿卜素對照品混合溶液超高效液相色譜(UPLC)圖。圖6為實施例1的供試品溶液的超高效液相色譜(UPLC)圖。圖7為實施例2的供試品溶液的超高效液相色譜(UPLC)圖。
具體實施方式
請參閱圖1 7所示，對本發明的實施例進行詳細的說明。一、實驗條件1、儀器與試藥超高效液相色譜儀為美國WATERS ACQUITY UPLC H_Class，包括四元溶劑管理器、自動進樣器、柱溫箱、PDA檢測器以及Empower色譜工作站；β -胡蘿卜素對照品，番茄紅素對照品，葉黃素對照品，β-隱黃質對照品為美國Sigma公司產品；乙睛和甲醇為色譜純，來自Fisher公司；其他試劑均為分析純。2、流動相各組分的體積比為乙腈:甲醇=9:1。3、本試驗選擇450nm作為類胡蘿卜素檢測吸收波長。4、提取劑為丙酮:石油醚=1:2提取劑且含0.1%BHT。二、保留時間和峰面積的重復性、精密度試驗取上述四種類胡蘿卜素對照品制成四種對照品溶液，在超高液相色譜儀中分別重復進樣5次，分別計算保留時間和峰面積的平均值、標準差和變異系數，來測定儀器的性能以及方法的精密型，結果見表1，四種類胡蘿卜素對照品保留時間的變異系數分別為
1.90%、1.43%、1.92%、1.91%,峰面積的變異系數分別為 1.38%、1.97%、1.98%、1.53%，均小于2%，說明超高液相色譜儀性能良好，用該方法測定類胡蘿卜素成分的重現性高。表I四種對照品的保留時間和峰面積的平均值、標準差和變異系數(n=5)
權利要求
1.一種草莓類胡蘿卜素成分的含量測定方法，其特征在于:采用超高效液相色譜法在同一色譜條件下對草莓果實中的4種分別為葉黃素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質以及番茄紅素的類胡蘿卜素成分同時進行含量測定；該方法包括如下步驟: (1)制備對照品溶液:分別稱取葉黃素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質、番茄紅素對照品，加丙酮得到四種單個對照品溶液；再分別精密量取四種單個對照品溶液，置同一容量瓶中，得到混合對照品溶液； (2)制備供試品溶液:精密稱定草莓果肉，用液氮快速研磨至粉末狀，置具塞錐形瓶中，精密加入丙酮:石油醚=1:2提取劑，于50°C下，避光浸提3小時，過濾出上清液；殘渣反復浸提至殘渣發白，合并上清液，用旋轉蒸發儀40°C蒸至糊狀；加入石油醚和10%K0H-甲醇，避光，室溫萃取，阜化過夜；然后過濾，將濾液轉入250ml分液漏斗中，并將分液漏斗下層的皂化液轉入錐形瓶，用石油醚反復萃取皂化液至石油醚層為無色，接著合并石油醚層至另一 250ml分液漏斗中，用雙蒸水反復洗滌石油醚層，去殘余的丙酮至雙蒸水層為中性，繼續加入無水硫酸鈉脫水后旋轉蒸發儀40°C蒸干，最后用丙酮定容，即得； (3)制定色譜條件: 儀器:WATERS ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜； 色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18 規格為 2.1mmX 50mm, 1.7u m 的色譜柱； 流動相:乙腈與甲醇； 流動相流速:0.5ml/min ； 檢測波長:450nm ； 進樣體積:5ul ； 柱溫:27°C ; (4)進行常規系統適應性試驗，注入超高效液相色譜儀進行葉黃素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質以及番茄紅素含量測定。
2.根據權利要求1所述一種草莓類胡蘿卜素成分的含量測定方法，其特征在于:流動相各組分的體積比為乙腈:甲醇=9:1。
3.根據權利要求1所述一種草莓類胡蘿卜素成分的含量測定方法，其特征在于:步驟(1)對照品溶液的制備為:分別精密稱取葉黃素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質、番茄紅素對照品各1.0mg，加丙酮定容于5ml容量瓶中，得到濃度為200ug/ml單個對照品溶液；分別精密量取單個對照品溶液，置同一容量瓶，得到混合對照品溶液。
4.根據權利要求1所述一種草莓類胡蘿卜素成分的含量測定方法，其特征在于:步驟(2)中加入的丙酮、石油醚以及10%K0H-甲醇中均含0.1%BHT。
全文摘要
本發明提供一種草莓類胡蘿卜素成分的含量測定方法，即采用超高效液相色譜法在同一色譜條件下對草莓果實中的4種分別為葉黃素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質以及番茄紅素的類胡蘿卜素成分同時進行含量測定，本發明以丙酮石油醚=12作為提取劑，皂化提取草莓果實中類胡蘿卜素，以乙腈甲醇=91為流動相，檢測吸收波長為450nm，檢測可以在5min內完成。本方法精密度高、靈敏度強、重復性好、回收率高，對草莓中4種類胡蘿卜素成分同時進行分離和含量測定，方法簡單快速，結果準確可靠，試劑用量少是適合草莓果實類胡蘿卜素定性和定量分析的最佳方法。
文檔編號G01N30/88GK103175934SQ201310069898
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者朱海生, 溫慶放, 陳敏氡 申請人:福建省農業科學院作物研究所