一種評價轉基因棉花對大草蛉影響的生物測定方法
【專利摘要】本發明提供了一種評價轉基因棉花對大草蛉影響的生物測定方法，包括在培養皿底部鋪入瓊脂；將轉基因棉花葉片放入瓊脂表面，接入初孵棉鈴蟲幼蟲；大草蛉初孵幼蟲先用豌豆蚜飼喂1-3天，之后用取食轉基因棉花葉片1-3天的棉鈴蟲幼蟲飼喂大草蛉幼蟲；從飼喂棉鈴蟲幼蟲第1天起每天觀察大草蛉幼蟲生長發育情況，直至化蛹、羽化；設置對照組；以大草蛉的化蛹率、羽化率、幼蟲重量、成蟲重量、總發育時間作為指標，比較處理組與對照組的差異，通過方差分析比較其差異顯著性，評價轉基因棉花對大草蛉的影響，該生物測定方法適用廣泛，對利用“轉基因植物-害蟲-捕食性天敵”營養關系評價轉基因植物中高劑量蛋白對捕食性天敵的影響都能夠進行有效測定。
【專利說明】一種評價轉基因棉花對大草蛉影響的生物測定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物保護【技術領域】，具體地說，涉及一種利用Bt抗性棉鈴蟲評價轉基因棉花對大草蛉生長發育影響的生物測定方法。
【背景技術】
[0002]大草蛉Chrysopa pallens屬于昆蟲綱，脈翅目，草蛉科。它是許多作物生態系統中普遍存在的、資源豐富的天敵，其幼蟲和成蟲都是捕食性的，可以取食蚜蟲、葉螨、鱗翅目的卵和低齡幼蟲等，捕食范圍廣泛。早期人們評價轉基因植物對草蛉的影響結果表明轉基因植物對草蛉沒有不良影響，如Li等的研究發現，普通草蛉取食表達CrylAb或Cry3Bbl的玉米花粉后，其存活率、產卵前期、生殖力、產卵量及成蟲干重與取食非轉基因玉米花粉的草蛉沒有顯著差異(Li&ROmeis，2010);雒捃瑜等發現和常規棉花相比，飼喂取食轉雙價抗蟲棉(表達CrylAc和Cry2Ab蛋白)和單價抗蟲棉(表達CrylAc蛋白)的棉鈴蟲初孵幼蟲，使中華草蛉Chrysoperla sinica Tjeder的生長發育時間延長,但差異未達到顯著水平(雒裙瑜等,2011)。但Hilbeck等的室內非選擇性生測結果卻表明普通草蛉Chrysopacarnea幼蟲在捕食Bt玉米上的歐洲玉米螟Ostrinia nubiIalis和埃及棉夜蛾SpodopteraIittoralis后,其死亡率高于對照；用加入CrylAb蛋白的人工飼料飼喂草蛉幼蟲,其死亡率仍然高于對照；但該報道之后的一系列試驗證明CrylAb對普通草蛉幼蟲沒有直接毒性(Hilbeck et al.，1998)。Romeis等認為以Bt敏感的昆蟲作為獵物對捕食性天敵的不利影響是因為Bt毒素造成獵物營養質量下降，進而間接影響了捕食性天敵的生長發育，并不是Bt本身對天敵的毒性造成的(Romeis et al.，2004)。Yu等也認為當前使用的抗蟲轉基因作物作用范圍較窄，對非靶標生物沒有直接的不利影響，而且提高了一些有益昆蟲的豐度和對害蟲的自然控制作用(Yu et al.，2011)。
[0003]2003年，孟山都公司通過雜交在Bollgard(轉基因抗蟲保鈴棉)基礎上轉入一個新的Cry2Ab基因，開發出表達CrylAc和Cry2Ab兩種不同殺蟲蛋白的Bollgard II。這個轉基因棉花品種，在美國、澳大利亞、南非、墨西哥和菲律賓等國家已開始商業化種植。所以研究這個品種對非靶標昆蟲的影響具有重要意義。
[0004]大草蛉能夠捕食取食轉基因棉葉的棉鈴蟲Helicoverpa armigera、棉姆Aphisgossypii Glover等,利用食物營養關系研究轉雙價抗蟲棉花中表達蛋白CrylAc和Cry2Ab對大草蛉的影響至關重要。利用抗性棉鈴蟲建立評價體系，使取食轉基因棉花的棉鈴蟲體內含有更多Bt蛋白，可以傳遞更多的蛋白到捕食棉鈴蟲的大草蛉體內，更有利于評價高劑量Bt對大草蛉的影響；而且由于棉葉的保鮮問題使棉鈴蟲的存活率較低，因此建立適用于“轉基因新鮮棉葉-抗性棉鈴蟲-大草蛉”評價體系的生物測定方法，是準確評價轉基因棉花對大草蛉影響的關鍵，結果將為轉基因作物的安全性評價奠定基礎。
[0005]Li Y, Romeis J.Bt maize expressing Cry3Bbldoes not harm the spidermite, Tetranychus urticae, or its ladybird beetle predator, Stethorus punctilium.B1logical Control, 2010，53(3):337-344。
[0006]雒裙瑜，崔金杰，辛惠江.轉CrylAc+Cry2Ab基因棉花對天敵生長發育的影響.中國棉花研究報告，2011，38(12): 11-36。
[0007]Hilbeck A，Baumgartner Mj Fried P M，et al.Effects of transgenicBacillus thuringiensis corn-fed prey on mortality and development timeof immature Chrysoperla cornea (Neuroptera:Chrysopidae)。Environmentalentomology, 1998，27(2):480-487。
[0008]Romeis J，Dutton A，Bigler F.Bacillus thuringiensis toxin(CrylAb)has nodirect effect on larvae of the green lacewing Chrysoperla carnea (Stephens)(Neuroptera:Chrysopidae).Journal of Insect Phys1logy，2004，50 (2):175-183。
[0009]Yu H Lj Li Y Hj Wu K M.Risk Assessment and ecological effects oftransgenic Bacillus thuringiensis crops on non-target organisms.Journal ofintegrative plant b1logy，2011，53(7):520-538。
【發明內容】
[0010]針對現有技術不足，本發明的目的是提供一種利用Bt抗性棉鈴蟲評價轉基因棉花對大草蛉生長發育影響的生物測定方法。
[0011]為實現上述目的，本發明提供一種評價轉基因棉花對大草蛉影響的生物測定方法，包括以下步驟:
[0012]I)在培養皿底部鋪入濃度為2%的瓊脂，此濃度瓊脂硬度適于棉花葉片的葉柄插入，同時達到保持葉片新鮮的目的；
[0013]2)將轉基因棉花葉片放入瓊脂表面，接入初孵棉鈴蟲幼蟲，使其取食轉基因棉葉1-3天，保證棉鈴蟲幼蟲體內一定的Bt蛋白含量；
[0014]3)大草蛉初孵幼蟲先用豌豆蚜飼喂1-3天，確保大草蛉的存活率，且增加大草蛉幼蟲的捕食棉鈴蟲的能力，之后用取食轉基因棉花葉片1-3天的棉鈴蟲幼蟲飼喂大草蛉幼蟲；
[0015]4)從飼喂棉鈴蟲幼蟲第I天起每天觀察大草蛉幼蟲生長發育情況，直至化蛹、羽化；
[0016]5)以取食常規非轉基因棉花葉片的棉鈴蟲幼蟲飼喂大草蛉幼蟲作為對照組；
[0017]6)在大草蛉取食4-5天棉鈴蟲后，以大草蛉的化蛹率、羽化率、最后一次取食棉鈴蟲后的幼蟲重量、羽化后24小時的成蟲重量、總發育時間等作為指標，比較處理組與對照組的差異，通過方差分析比較其差異顯著性，評價轉基因棉花對大草蛉的影響:如果差異顯著，表明存在影響；反之，不存在影響。
[0018]優選的，步驟5)中，如果與取食豌豆蚜的大草蛉幼蟲相比，對照組中大草蛉幼蟲生長緩慢，需同時給處理組和對照組的大草蛉幼蟲補充營養，使大草蛉幼蟲順利完成生活史。
[0019]優選的，取食非轉基因棉花親本的葉片，以排除其他影響因素。
[0020]優選的，通過飼喂豌豆蚜和/或鱗翅目害蟲卵補充營養。
[0021]優選的，采用隔天補充營養:一天棉鈴蟲幼蟲、一天豌豆蚜和/或鱗翅目害蟲卵，或者采用后期補充營養。
[0022]優選的，將瓊脂粉與蒸餾水混合得到的2 %瓊脂溶液加熱煮沸，將熱的瓊脂溶液倒入一次性塑料培養皿中冷卻至室溫制得2%的瓊脂。
[0023]優選的，所述步驟2)中轉基因棉花葉片為苗期5葉期的葉片。
[0024]優選的，葉片反面貼放在瓊脂表面，可以更好保濕，且有利于棉鈴蟲取食。
[0025]優選的，所述初孵棉鈴蟲室內用Bt (如CrylAc、Cry2Ab、Vip3Aa等)篩選的抗性棉鈴蟲，品系的選擇根據需要測定的轉基因棉花中表達的相應Bt蛋白種類而確定，以敏感棉鈴蟲為對照。
[0026]優選的，所述大草蛉和棉鈴蟲飼養條件為:溫度25±2°C，濕度75±10%，光照16:8(L:D)h。
[0027]優選的，所述大草蛉每天飼喂5-10頭棉鈴蟲幼蟲。
[0028]具體地，本發明提供了一種利用Bt抗性棉鈴蟲評價轉基因棉花對大草蛉影響的生物測定方法，包括如下步驟:
[0029]I)將瓊脂粉Agar與蒸餾水混合得到的2%瓊脂溶液加熱煮沸，將熱的瓊脂溶液30-40ml倒入上表面直徑9cm，底面直徑8.7cm的一次性塑料培養皿中冷卻I小時至室溫；
[0030]2)轉基因棉花苗期5葉期葉片反面貼放在冷卻的瓊脂表面，接入初孵Bt抗性棉鈴蟲幼蟲或敏感棉鈴蟲，使其取食轉基因棉花葉片2天，用橡膠圈繃緊培養皿防止棉鈴蟲初孵幼蟲逃逸；
[0031]3)大草蛉初孵幼蟲先用豌豆蚜飼喂2天，之后用取食轉基因棉花葉片2天的棉鈴蟲幼蟲飼喂大草蛉幼蟲，每天更換新鮮棉鈴蟲幼蟲；
[0032]4)從飼喂棉鈴蟲幼蟲第I天起每天觀察大草蛉幼蟲生長發育情況，直至化蛹、羽化；
[0033]5)以取食常規非轉基因棉花親本葉片的棉鈴蟲幼蟲飼喂大草蛉幼蟲作為對照組；
[0034]6)在大草蛉取食5天棉鈴蟲后，以大草蛉的化蛹率、羽化率、最后一次取食棉鈴蟲后的幼蟲重量、羽化后24小時的成蟲重量、總發育時間等作為指標，比較處理組與對照組的差異，通過方差分析比較其差異顯著性，評價轉基因棉花對大草蛉的影響:如果差異顯著，表明存在影響；反之，不存在影響。
[0035]本發明的優點在于，該生物測定方法適用廣泛，對利用“轉基因植物-害蟲-捕食性天敵”營養關系，評價轉基因植物中高劑量蛋白對捕食性天敵的影響都能夠進行有效測定。并利用瓊脂的保濕作用解決了轉基因棉花葉片的保鮮問題，而且能夠使大草蛉幼蟲階段捕食到棉鈴蟲和豌豆蚜，可以使測定更接近實際田間狀況，具有很強的實用性。
【具體實施方式】
[0036]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0037]實施例1
[0038]將瓊脂粉與蒸餾水混合得到的2%瓊脂溶液加熱煮沸，將熱的瓊脂溶液倒入一次性塑料培養皿中冷卻至室溫；將供試的轉基因棉花苗期葉片反面貼放在冷卻的瓊脂表面，接入初孵CrylAc抗性棉鈴蟲幼蟲或敏感棉鈴蟲，用橡膠圈繃緊培養皿防止棉鈴蟲初孵幼蟲逃逸。
[0039]棉花品種:轉基因棉花33B (表達CrylAc蛋白)、轉雙價棉花品種Bollgard II (表達CrylAc+Cry2Ab)、非轉基因棉花親本33。棉鈴蟲品系:Cry IAc抗性品系(在室內用CrylAc蛋白篩選的棉鈴蟲抗性品系)、敏感棉鈴蟲。
[0040]將大草蛉初孵幼蟲用豌豆蚜飼養2天，然后用取食轉基因棉花(33B、Bollgard II ) 2天的棉鈴蟲幼蟲飼喂大草蛉幼蟲，每天更換新的棉鈴蟲幼蟲，待大草蛉取食棉鈴蟲幼蟲5天后，改用充足的豌豆蚜每天飼喂大草蛉，觀察記錄大草蛉生長發育情況直至羽化。
[0041]每個棉花品種處理每天接90頭棉鈴蟲初孵幼蟲(每培養皿接30頭)，連續接5天。棉鈴蟲取食兩天后選取生長良好的幼蟲飼喂給大草蛉幼蟲，每頭大草蛉每天給予5-10頭的棉鈴蟲。5天后給予大草蛉幼蟲足夠的豌豆蚜，從取食棉鈴蟲開始,每天記錄大草蛉幼蟲的存活及蛻皮情況并稱重。試驗重復3次，評價棉葉中的蛋白通過棉鈴蟲對大草蛉的影響。
[0042]對照組飼喂非轉基因棉花親本33，其余操作相同。
[0043]敏感棉鈴蟲取食轉基因棉花兩天后，幼蟲表現為明顯的死亡或拒食現象，幼蟲不能正常生長，因此沒有繼續飼喂給大草蛉。其他處理的結果如表1所示。
[0044]表1轉基因棉花對大草蛉的生物學參數影響
[0045]
【權利要求】
1.一種評價轉基因棉花對大草蛉影響的生物測定方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)在培養皿底部鋪入濃度為2%的瓊脂； 2)將轉基因棉花葉片放入瓊脂表面，接入初孵棉鈴蟲幼蟲，使其取食轉基因棉花葉片1_3 天； 3)大草蛉初孵幼蟲先用豌豆蚜飼喂1-3天，之后用取食轉基因棉花葉片1-3天的棉鈴蟲幼蟲飼喂大草蛉幼蟲，每天更換新鮮棉鈴蟲幼蟲； 4)從飼喂棉鈴蟲幼蟲第I天起每天觀察大草蛉幼蟲生長發育情況，直至化蛹、羽化； 5)以取食常規非轉基因棉花葉片的棉鈴蟲幼蟲飼喂大草蛉幼蟲作為對照組； 6)以大草蛉的化蛹率、羽化率、最后一次取食棉鈴蟲后的幼蟲重量、羽化后24小時的成蟲重量、總發育時間作為指標，比較處理組與對照組的差異，通過方差分析比較其差異顯著性，評價轉基因棉花對大草蛉的影響:如果差異顯著，表明存在影響；反之，不存在影響。
2.根據權利要求1所述的生物測定方法，其特征在于，步驟5)中，如果與取食豌豆蚜的大草蛉幼蟲相比，對照組中大草蛉幼蟲生長緩慢，需同時給處理組和對照組的大草蛉幼蟲補充營養，使大草蛉幼蟲順利完成生活史。
3.根據權利要求2所述的生物測定方法，其特征在于，通過飼喂豌豆蚜和/或鱗翅目害蟲卵補充營養。
4.根據權利要求3所述的生物測定方法，其特征在于，采用隔天補充營養:一天棉鈴蟲幼蟲、一天豌豆蚜和/或鱗翅目害蟲卵。
5.根據權利要求1-4任一所述的生物測定方法，其特征在于，所述步驟2)中轉基因棉花葉片為苗期5葉期的葉片。
6.根據權利要求5所述的生物測定方法，其特征在于，葉片反面貼放在瓊脂表面。
7.根據權利要求1-4任一所述的生物測定方法，其特征在于，所述初孵棉鈴蟲用Bt篩選的抗性棉鈴蟲，品系的選擇根據需要測定的轉基因棉花中表達的相應Bt蛋白種類而確定，以敏感棉鈴蟲為對照。
8.根據權利要求1-4任一所述的生物測定方法，其特征在于，所述大草蛉每天飼喂5-10頭棉鈴蟲幼蟲。
【文檔編號】G01N33/48GK104133054SQ201410318625
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月4日 優先權日:2014年7月4日
【發明者】王英麗, 梁革梅, 魏紀珍, 袁向東, 趙曼 申請人:中國農業科學院植物保護研究所
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