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一種電化學免疫傳感器及其制備與應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種檢測赭曲霉毒素A的電化學免疫傳感器，包括工作電極、參比電極和對電極，所述工作電極為先在基底電極表面修飾羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料，而后固定赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶聯物所得。應用本發明的傳感器對赭曲霉毒素A進行檢測，赭曲霉毒素A的濃度在0.01-100ng/ml范圍內呈線性關系，線性方程式為Y=6.3155E-6-2.89458E-6X，相關系數為0.99984，最低檢測限為0.004ng/ml。與現有技術比較，所述傳感器靈敏度高、特異性好、成本低、操作簡便，檢測周期短，適用于實際樣品的測定等，有望成為具有實際應用價值的傳感器。
【專利說明】一種電化學免疫傳感器及其制備與應用

【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及電化學領域，尤其涉及一種電化學免疫傳感器及其制備與應用。

【背景技術】
[0002]赭曲霉毒素是由曲霉菌屬和青霉菌屬幾種菌產生的次生代謝產物，具有致畸、致癌、致突變、免疫學毒性等，國際癌癥研究機構(IARC)將赭曲霉毒素定為2B類致癌物,分為赭曲霉素A、B、C等結構類似的化合物，其中以赭曲霉毒素A(OTA)毒性最大。OTA產生菌廣泛分布于自然界，糧谷類、葡萄及葡萄酒、中草藥、豆制品、啤酒、茶葉等多種農作物和食品均可被OTA污染。近年來關于赭曲霉毒素的危害已引起世界各國的極大關注，許多國家對其制定了最聞允許量。
[0003]高效液相色譜在最近的OTA國際標準體系中已經處于絕對的主導地位，作為定量的檢測方法，在國內外實驗室和檢測機構得到普遍的使用。采用高效液相色譜法，或者質譜聯用法對OTA進行檢測，雖然具有結果準確、回收率高、精密度良好、重現性好等優點，但是成本高、操作過程復雜、時間長，無法滿足現場檢測的需要。
[0004]基于免疫學原理的酶聯免疫法檢測OTA具有簡便、快速、靈敏等特點，為快速大規模篩檢提供了極大的幫助。但由于該類方法在檢測復雜基質樣品時，檢測結果假陽性多。因此陽性樣品應該用儀器法進行復測。
[0005]電化學免疫傳感器是將免疫技術和電化學檢測技術相結合的一種新分析方法，利用信號轉換器(電化學工作站)把分子識別器(探針)與被測對象發生的物理或化學變化轉變成電信號。該技術具有快速、靈敏、選擇性高、操作簡便等特點，因此應用電化學免疫傳感器檢測樣品中OTA具有非常重要的意義。
[0006]電化學免疫傳感器自建立以來，主要應用于重大疾病標志物的檢測。近年來，該技術逐步被應用于食品中真菌毒素的檢測，但相對文獻較少，尤其針對食品中OTA的電化學生物傳感器檢測技術的研究與應用尚不成熟。
[0007]為了彌補現有技術OTA檢測的不足，旨在建立一種新型電化學免疫傳感器用于OTA的快速、靈敏檢測。


【發明內容】

[0008]鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的第一方面提供一種檢測赭曲霉毒素A (OTA)的電化學免疫傳感器，包括工作電極、參比電極和對電極，所述工作電極為先在基底電極表面修飾羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料(SWNTs-COOH/CS)，而后固定赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶聯物(OTA-BSA)所得。
[0009]優選地，所述基底電極選自玻碳電極。
[0010]優選地，所述羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料(SWNTs-COOH/CS)為將羧基化單壁碳納米管(SWNTs-COOH)分散于殼聚糖(CS)中制得。
[0011 ] 優選地，所述羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料(SWNTs-COOH/CS)中，羧基化單壁碳納米管與殼聚糖的質量比為1:1?12:1 ;更優選為1:1。
[0012]優選地，每個所述工作電極上，羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料(SWNTs-COOH/CS)中羧基化單壁碳納米管的質量為I?12ug，更優選為2ug。
[0013]優選地，所述工作電極上，羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料(SWNTs-COOH/CS)中羧基化單壁碳納米管與赭曲霉毒素A-牛血清清蛋白偶聯物(OTA-BSA)的質量比為
6.67:1?2400:1，更優選為6.67:1?80:1，最優選為40:1。進一步地，所述電化學免疫傳感器中的參比電極和對電極與工作電極構成三電極系統。
[0014]優選地，所述參比電極選自飽和甘汞電極或銀氯化銀電極(Ag/AgCl)之任意一種；更優選地，所述參比電極為銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極。
[0015]優選地，所述對電極為鉬絲電極。
[0016]本發明第二方面提供了前述電化學免疫傳感器中的工作電極的制備方法，所述方法為先在基底電極表面修飾羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料(SWNTs-COOH/CS)，而后再固定赭曲霉毒素A-牛血清清蛋白偶聯物(OTA-BSA)。
[0017]優選地，所述工作電極按照以下步驟制備:
[0018]I)制備羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料(SWNTs-COOH/CS):
[0019]將殼聚糖溶解于醋酸溶液中，制備殼聚糖溶液；將羧基化單壁碳納米管(SWNTs-COOH)溶解于所得殼聚糖溶液中，得SWNTs-COOH/CS復合材料混懸液；
[0020]2)工作電極的修飾及功能化:
[0021](I)基底電極表面處理:將基底電極表面進行拋光處理，使其表面光潔；
[0022](2)修飾單壁碳納米管/殼聚糖納米復合材料(SWNTs-C00H/CS):將步驟I)中制備的SWNTs-COOH/CS混懸液滴涂到步驟(I)中處理好的基底電極表面，晾干成膜，得到羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料修飾電極(SWNTs-COOH/CS/GCE)；
[0023](3)采用活化液活化所得SWNTs-COOH/CS/GCE中SWNTs-COOH上的羧基基團；
[0024](4)固定赭曲霉毒素A-牛血清清蛋白偶聯物(OTA-BSA):在活化后的SWNTs-COOH/CS/GCE 上加 0TA-BSA，孵育，形成 0TA-BSA-SWNTs-C00H/CS/GCE，BSA 封閉非特異性吸附位點，即得工作電極。
[0025]優選地,步驟I)中，殼聚糖的分子式(C6H11NO4)n,單兀體的分子量為161.2。
[0026]優選地，步驟I)中，醋酸溶液的濃度為I %。
[0027]優選地,步驟I)中，殼聚糖溶液的濃度為0.5?6mg/mL,更優選為lmg/mL。
[0028]優選地，步驟I)中，SWNTs-COOH/CS復合材料混懸液中，羧基化單壁碳納米管與殼聚糖的質量比為1:1?12:1 ;更優選為1:1。
[0029]優選地，步驟I)中，SWNTs-C00H/CS復合材料混懸液中，SffNTs-COOH的終濃度為
0.5 ?6.0mg/ml ;更優選為 1.0mg/ml。
[0030]優選地，步驟⑴中，所述基底電極選自玻碳電極。
[0031]優選地，步驟(I)中，可采用氧化鋁粉對所述基底電極進行拋光處理。
[0032]優選地，步驟(2)中所修飾的單壁碳納米管/殼聚糖納米復合材料(SWNTs-COOH/CS)中，羧基化單壁碳納米管與殼聚糖的質量比為1:1?12:1 ;更優選為1:1。
[0033]優選地，步驟(2)中，每個工作電極上所修飾的羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料(SWNTs-COOH/CS)中羧基化單壁碳納米管的質量為I?12ug，更優選為2ug。
[0034]優選地，步驟(3)中，所述活化液為為EDC和NHS的混合液EDC/NHS。更優選地，EDC/NHS中EDC的濃度為10mg/ml，NHS的濃度為4mg/ml，EDC與NHS的質量比為5mM:2mM。
[0035]優選地，步驟(4)中，赭曲霉毒素A-牛血清清蛋白偶聯物(OTA-BSA)的濃度為
0.5 ?15.0ug/ml ;更優選地，OTA-BSA 的濃度為 5.0ug/ml。
[0036]優選地，步驟(2)中所修飾的單壁碳納米管/殼聚糖納米復合材料(SWNTs-COOH/CS)中羧基化單壁碳納米管與步驟(4)中所固定的赭曲霉毒素A-牛血清清蛋白偶聯物(OTA-BSA)的質量比為6.67:1?2400:1，更優選為6.67:1?80:1，最優選為40:1。
[0037]本發明第三方面提供了一種檢測赭曲霉毒素A的檢測體系，包括本發明第一方面所述的電化學免疫傳感器、OTA單克隆抗體、二抗和免疫反應緩沖體系。
[0038]優選地，所述二抗為堿性磷酸酶標記二抗。
[0039]進一步的，可選擇堿性磷酸酶標記的馬抗鼠，兔抗鼠，羊抗鼠等任意來源的抗鼠的二抗，更優選為堿性磷酸酶標記馬抗小鼠IgG (H+L)。
[0040]優選地，所述免疫反應緩沖體系為含α -NP的二乙醇胺(DEA)緩沖液。
[0041]本發明第四方面提供了一種檢測赭曲霉毒素A的方法，為采用前述的電化學免疫傳感器或檢測體系對樣品中的赭曲霉毒素A進行檢測，所述方法具體包括以下步驟:
[0042](a)在前述構建的電化學免疫傳感器的工作電極上同時加入樣品溶液和一定量OTA單克隆抗體溶液；
[0043](b)加入適量的堿性磷酸酶標記的二抗，孵育，通過與OTA單克隆抗體選擇性地結合到電極表面；
[0044](C)將工作電極置于免疫反應緩沖體系中，并將工作電極、參比電極以及對電極正確連接到電化學工作站上，用差分脈沖伏安(DPV)進行測定。
[0045]優選地，步驟(a)中，OTA單克隆抗體溶液的濃度為1.25?20.0ug/ml ;更優選為5.0ug/ml ο
[0046]優選地，步驟(b)中，所述堿性磷酸酶標記二抗為堿性磷酸酶標記馬抗小鼠IgG (H+L)。
[0047]更優選地，所述堿性磷酸酶標記馬抗小鼠IgG(H+L)的稀釋比例為:1:50?1:400 ;最佳為 1:200。
[0048]優選地，步驟(c)中，所述參比電極選自飽和甘汞電極或銀氯化銀電極(Ag/AgCl)之任意一種；更優選地，所述參比電極為銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極。
[0049]優選地，步驟(C)中，所述對電極為鉬絲電極。
[0050]優選地，步驟(C)中，所述免疫反應緩沖體系為含α-ΝΡ的二乙醇胺(DEA)緩沖液。
[0051]更優選地，所述免疫反應緩沖體系中α -NP的濃度為0.25?1.5mg/ml ;最佳為
0.75mg/mL。
[0052]本發明第五方面提供了前述電化學免疫傳感器或檢測體系在檢測赭曲霉毒素A中的用途。
[0053]本發明的有益效果為:
[0054](I)本發明研制了一種基于單壁碳納米管/殼聚糖復合材料(SWNTs-COOH/CS)固定抗原(OTA-BSA)的間接競爭電化學免疫傳感器，可以用于靈敏地檢測0ΤΑ。首先制得穩定性良好的單壁碳納米管/殼聚糖復合材料(SWNTs-COOH/CS)修飾于玻碳電極表面，再通過吸附作用將赭曲霉毒素-牛血清白蛋白交聯物(OTA-BSA)固定到修飾過的電極表面。檢測時，加入樣品與一定量的OTA單克隆抗體(ant1-OTA)，樣品中的游離OTA與工作電極表面一定量的固定化的OTA-BSA耦合物競爭結合單克隆抗體，競爭反應過后，再加入堿性磷酸酶標記的二抗，二抗特異性地與電極表面所捕獲的一抗反應，進而堿性磷酸酶催化底物α-萘基磷酸鹽水解，在電極表面產生電信號。所述電化學免疫傳感器的線性范圍為
0.01 — 100ng/ml，線性方程式為Y = 6.3155Ε_6_2.89458Ε_6Χ，檢測限位4pg/ml，線性相關系數為 0.99984。
[0055](2)眾所周知，OTA-BSA只有在生物相容性的環境中才能保持其活性。將其直接固定到電極表面通常會引起抗體的構想改變，從而導致喪失生物活性。因此，如何有效地把OTA-BSA固定在電極上是本發明的電化學免疫傳感器制備的一個關鍵步驟。由于本發明中工作電極表面修飾的SWNTs-COOH/CS復合材料具有非常大的比表面積以及良好的生物相容性，所以能夠牢固地吸附0TA-BSA，檢測時，能夠有效增加抗體的負載量，并保持抗體的生物活性。
[0056]此外，SWNTs-C00H/CS復合材料還具有較好的電子傳導作用，能夠增加GCE和樣品溶液之間的電子轉移，提高導電性能，顯著增加了 OTA測定的靈敏度，很好地降低OTA分析的檢測下限。
[0057](3)與此同時，信號放大是影響檢測靈敏度的另一個重要因素。本發明采用了基于碳納米管和堿性磷酸酶的雙放大策略，極大地實現了信號放大。在本發明中，堿性磷酸酶(AP)被引進電極表面催化α-萘基磷酸鹽(α-ΝΡ)水解而產生電化學信號，增強了電化學響應信號，可對樣品中的OTA濃度進行準確的定量。
[0058](4)綜上所述，本發明成功構建了可用于檢測赭曲霉毒素A(OTA)的電化學免疫傳感器及檢測體系，應用本發明的傳感器，對OTA的測定顯示了靈敏度高、穩定、重現性好的能力。與現有技術比較，本發明的傳感器成本低，操作簡單方便，檢測周期短，特異性好，假陽性率和假陰性率低。適用于實際樣品的測定等，有望成為具有實際應用價值的傳感器。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0059]圖1為本發明實施例1的SWNTs-COOH/CS復合材料混懸液用S-300N掃描電鏡觀察結果。
[0060]圖2為本發明實施例1每一步不同修飾電極在5mM的鐵氰化鉀溶液中的方波伏安響應曲線，其中
[0061]a 為裸 GCE;
[0062]b 為 SWNTs-C00H/CS/GCE ；
[0063]c 為 OTA-BSA-SWNTs-COOH/CS/GCE ；
[0064]d 為 ant1-0TA/0TA-BSA-SWNTs-C00H/CS/GCE ；
[0065]e 為 AP-ant1-antibody/ant1-0TA/0TA-BSA-SWNTs-C00H/CS/GCE。
[0066]圖3為本發明實施例1每一步不同修飾電極所對應的循環伏安響應曲線，其中
[0067]a 為裸 GCE ；
[0068]b 為 SWNTs-C00H/CS/GCE ；
[0069]c 為 OTA-BSA-SWNTs-COOH/CS/GCE ；
[0070]d 為 ant1-OTA/OTA-BSA-SWNTs-COOH/CS/GCE ；
[0071]e 為 AP-ant1-antibody/ant1-OTA/OTA-BSA-SWNTs-COOH/CS/GCE。
[0072]圖4為對比試驗中各個傳感器的電流響應曲線圖，其中曲線a，b, c分別為在裸玻碳電極，玻碳電極修飾SWNTs-C00H/CS/GCE，玻碳電極修飾SWNTs_C00H/GCE基礎上構建傳感器之后的電流信號響應曲線。
[0073]圖5為不同濃度的OTA-BSA所構建的電化學免疫傳感器差分脈沖伏安掃描結果。
[0074]圖6為不同濃度的ant1-OTA所構建的電化學免疫傳感器差分脈沖伏安掃描結果。
[0075]圖7為不同稀釋比例的AP-ant1-antibody所構建的電化學免疫傳感器差分脈沖伏安掃描結果。
[0076]圖8為不同濃度的α -NP所構建的電化學免疫傳感器差分脈沖伏安掃描結果。
[0077]圖9為本發明的電化學免疫傳感器在五個不同濃度(100ng/ml，10ng/ml, lng/ml, 0.lng/ml, 0.0lng/ml)的OTA標準品溶液中孵育，DPV法記錄電流值ip所得曲線圖。
[0078]圖10為本發明的電化學免疫傳感器檢測OTA時的標準曲線。
[0079]圖11為本發明制備的免疫傳感器的特異性分析實驗結果。

【具體實施方式】
[0080]以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的【具體實施方式】加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發明的精神下進行各種修飾或改變。
[0081]須知，下列實施例中未具體注明的工藝設備或裝置均采用本領域內的常規設備或裝置；所有壓力值和范圍都是指絕對壓力。
[0082]此外應理解，本發明中提到的一個或多個方法步驟并不排斥在所述組合步驟前后還可以存在其他方法步驟或在這些明確提到的步驟之間還可以插入其他方法步驟，除非另有說明；還應理解，本發明中提到的一個或多個設備/裝置之間的組合連接關系并不排斥在所述組合設備/裝置前后還可以存在其他設備/裝置或在這些明確提到的兩個設備/裝置之間還可以插入其他設備/裝置，除非另有說明。而且，除非另有說明，各方法步驟的編號僅為鑒別各方法步驟的便利工具，而非為限制各方法步驟的排列次序或限定本發明可實施的范圍，其相對關系的改變或調整，在無實質變更技術內容的情況下，當亦視為本發明可實施的范疇。
[0083]實施例1制備電化學免疫傳感器
[0084]1.材料與方法
[0085]1.1 材料
[0086]赭曲霉毒素A-牛血清清蛋白偶聯物(OTA-BSA)、OTA單克隆抗體(ant1-OTA)購自北京華安麥科生物技術有限公司、堿性磷酸酶標記馬抗小鼠IgG(H+L)購自美國Vector實驗室、OTA標準品、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、α -萘基磷酸鹽(α -NP)、殼聚糖(CS)均購自美國Sigma-Aldrich公司，羧基化單壁碳納米管購自深圳納米港有限公司，甲醇、丙酮等其他試劑均購自重慶茂業化學試劑有限公司。
[0087]1.2檢測儀器
[0088]CHI660D型電化學工作站為上海辰華儀器公司產品。
[0089]1.3檢測原理
[0090]在玻碳電極表面通過直接涂覆法修飾鋪上一層羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料(SWNTs-COOH/CS)，并利用EDC/NHS活化SWNTs-COOH上的羧基。將OTA-BSA通過蛋白質氨基端與羧基化單壁碳納米管SWNTs-COOH上的活化羧基反應連接，并通過抗原抗體反應與同時加入的OTA單體來競爭吸附OTA單克隆抗體(ant1-OTA)，再加入堿性磷酸酶標記馬抗小鼠IgG(H+L) 二抗，通過堿性磷酸酶與底物α-萘基磷酸鹽(α-ΝΡ)反應產生的電化學信號繪制標準曲線和得到實測樣品OTA水平。
[0091]2.工作電極的制備
[0092]2.1羧基化單壁碳納米管/殼聚糖(SWNTs-COOH/CS)復合材料的制備
[0093]將殼聚糖粉末溶解于I %醋酸溶液中，制備濃度為lmg/ml的殼聚糖溶液；
[0094]取5.0ml lmg/ml殼聚糖溶液加入5.0mg羧基化單壁碳納米管(SWNTs-COOH)超聲分散2h得均勻穩定分散良好的SWNTs-COOH/CS復合材料混懸液，其中SWNTs-COOH的終濃度為lmg/ml。在使用之前,于4°C低溫保存。
[0095]2.2工作電極的修飾及功能化
[0096](I)玻碳電極表面處理:玻碳電極(GCE)在使用前用氧化鋁粉拋光至鏡面，先后分別用超純水和體積比為1:1的丙酮和硝酸中超聲幾分鐘。隨后再次將電極用超純水超聲幾分鐘，再用去離子水沖洗干凈，在室溫下晾干。
[0097](2)將2 μ L預先準備好的SWNTs-C00H/CS混懸液(lmg mL—1)小心地滴涂在處理干凈的玻碳電極表面。然后，在室溫下將修飾的玻碳電極過夜晾干得到羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料修飾電極(SWNTs-COOH/CS/GCE)。
[0098](3)將所制備的 SWNTs-C00H/CS/GCE 用磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01mol/L, pH7.4)清洗后，浸入新鮮配置的EDC/NHS活化液(EDC與NHS的濃度比為，5mM:2mM)中，于37°C溫育Ih,活化SWNTs-COOH上的羧基基團。
[0099](4)活化后的SWNTs-COOH/CS/GCE再用PBS緩沖液徹底清洗。將10 μ L的OTA-BSA(5 μ g mL O立即滴于電極表面,37°C溫育1.5h。孵育完全之后,將制備的電極用PBS清洗。于室溫在1yLl^牛血清白蛋白(BSA)中封閉電極表面未反應的活性位點。最后，以PBS徹底清洗電極，得OTA-BSA-SWNTs/CS/GCE并置于4°C的冰箱中待用。
[0100]3.電化學免疫傳感器的使用
[0101](I)將 5μ L 用 PBS(pH7.4)稀釋到一定濃度的 OTA(O ?500ng ml/1)和5 μ LlO μ g mr1的OTA單克隆抗體(ant1-OTA)均勻混合，滴加在修飾了 OTA-BSA的電極OTA-BSA-SWNTs/CS/GCE 表面，37°C溫育 90min，得 ant1-OTA-OTA-BSA-SWNTs/CS/GCE。在反應過程中，電極上固定的OTA-BSA與游離在混合液中的OTA共同競爭固定量的ant1-OTA。
[0102](2)然后再用PBS緩沖液(pH7.4)清洗電極，置于10 μ L1:200稀釋的堿性磷酸酶標記馬抗小鼠IgG(H+L) 二抗中，37°C溫育90min，PBS緩沖液(pH7.4)清洗后，得AP-ant1-antibody/ant1-0TA/0TA-BSA-SWNTs-C00H/CS/GCE。
[0103](3)以現配制的含0.75mg mL—1 α -NP的二乙醇胺(DEA)緩沖液作為免疫反應緩沖體系，將工作電極置于其中，Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對電極，在室溫下，用差分脈沖伏安法(DPV)進行測定。
[0104]4.對比試驗
[0105]在同一實驗條件下，以裸玻碳電極和玻碳電極表面只羧基化單壁碳納米管(SWNTs-COOH)所得工作電極GCE、SffNTs-COOH/GCE所構建的電化學免疫傳感器為對照。
[0106]實施例2電化學免疫傳感器的表征和檢驗
[0107]1.對SWNTs-COOH/CS復合材料膜的表征
[0108]對實施例1中所得SWNTs-COOH/CS復合材料混懸液用S-300N掃描電鏡進行掃描觀察，如圖1a和Ib顯示，該納米復合材料中碳管成明顯的管狀，在溶液中分散均勻。
[0109]在玻碳電極表面滴涂SWNTs-COOH/CS，在室溫晾干成膜后，肉眼觀察在電極:SWNTs-COOH/CS/GCE表面可見一層均勻的膜狀物質。
[0110]2.不同修飾電極的電化學表征
[0111]如圖2所示，是每一步不同修飾電極在5mM的鐵氰化鉀溶液中的方波伏安響應曲線.
[0112]a 為裸 GCE ；
[0113]b 為 SWNTs-COOH/CS/GCE ；
[0114]c 為 OTA-BSA-SWNTs-COOH/CS/GCE ；
[0115]d 為 ant1-0TA/0TA-BSA-SWNTs-C00H/CS/GCE ；
[0116]e 為 AP-ant1-antibody/ant1-0TA/0TA-BSA-SWNTs-C00H/CS/GCE。
[0117]當裸GCE表面修飾SWNTs-COOH/CS之后，峰值電流明顯增大(圖2-曲線b)，結果說明SWNTs-COOH/CS薄膜能夠促進溶液中的電子在電極表面的轉移。當OTA-BSA滴加到活化的電極表面后，由于蛋白質的空間位阻現象和絕緣作用對電子轉移構成了阻礙，峰值電流呈現明顯的降低(圖2-曲線c)。當電極通過ant1-OTA的進一步修飾孵育后，增加的電阻使得峰值電流進一步降低(圖2-曲線d)，表明制備的電化學免疫傳感器工作電極中OTA-BSA對ant1-OTA進行了成功的識別與結合作用。當把一定濃度的AP-ant1-antibody滴加到修飾后的電極表面孵育過后，峰值電流再一步降低(圖2-曲線e),表明AP-ant1-antibody成功的引入電化學免疫傳感器的工作電極上。
[0118]圖3為每一步不同修飾電極所對應的循環伏安響應曲線，
[0119]a 為裸 GCE ；
[0120]b 為 SWNTs-C00H/CS/GCE ;
[0121]c 為 OTA-BSA-SWNTs-COOH/CS/GCE ；
[0122]d 為 ant1-0TA/0TA-BSA-SWNTs-C00H/CS/GCE ；
[0123]e 為 AP-ant1-antibody/ant1-0TA/0TA-BSA-SWNTs-C00H/CS/GCE。
[0124]結果與圖2呈現出有良好的一致性，有效地證明我們成功地對電極進行了每一步的修飾。
[0125]3.對比實驗:
[0126]如圖4所示，曲線a, b，c分別為在裸玻碳電極，玻碳電極修飾SWNTs-C00H/CS/GCE,玻碳電極修飾SWNTs-COOH/GCE基礎上構建傳感器之后的電流信號響應曲線。曲線a表明蛋白質不能直接有效地固定在裸玻碳電極表面，所以響應電流很低；曲線c表明僅碳管在電極表面成膜之后，能夠通過其羧基端與蛋白質氨基端形成穩定的結合，把抗原固定在電極表面，所以其電流響應值比用裸玻碳電極構建的傳感器高，但如圖所示，運用單一SWNTs-COOH修飾電極構建傳感器有一個缺點，即其響應電流的基線很高，而且不穩定；曲線b運用SWNTs-COOH/CS復合材料修飾電極之后構建的傳感器，不僅能夠高效地固定檢測抗原，而且還能有效降低和穩定該傳感器電流響應的基線，并且該復合材料修飾電極之后對響應電流的大小并不影響。因此，采用SWNTs-COOH/CS修飾電極作為工作電極構建用于檢測OTA的電化學免疫傳感器具有不可比擬的優勢。
[0127]實施例3電化學免疫傳感器及其使用條件的優化
[0128]我們還對實驗過程中幾個重要的條件即SWNTs-COOH/CS復合混懸液中SffNTs-COOH的終濃度、OTA-BSA的濃度、ant1-OTA的濃度、AP-ant1-antibody的稀釋比例、α -NP的濃度這幾個測定條件進行了進一步的優化。對每一個條件都由低濃度到高濃度分別選取五個點進行一系列實驗。
[0129]1.為考察SWNTs-C00H/CS復合材料混懸液中SWNTs-COOH的終濃度大小對電化學免疫傳感器的影響，本實驗采用了不同濃度的(0.5，1.0,2.0,4.0,6.0mg/ml) SWNTs-COOH/CS復合混懸液構建電化學免疫傳感器。結果表明，SffNTs-COOH的終濃度太低，其成膜性差，不能很好地吸附OTA-BSA及固定抗體，而且如果膜中分散的SWNTs-COOH較少，促進電子傳遞的作用較弱；若SWNTs-COOH的終濃度太大，則成膜厚度增加，也會阻礙電子傳遞。實驗發現，SffNTs-COOH終濃度為0.5?6.0mg/ml的SWNTs-C00H/CS復合混懸液均能夠實現構建符合要求的傳感器，其中以SWNTs-COOH終濃度為1.0mg/ml的SWNTs-COOH/CS復合混懸液為最佳。
[0130]2.為考察OTA-BSA濃度大小對電化學免疫傳感器的影響，本實驗采用了不同濃度的(0.5，1.0,5.0,10.0,15.0ug/ml) OTA-BSA構建免疫電化學免疫傳感器，然后進行差分脈沖伏安掃描。如圖5可見，響應電流隨著OTA-BSA濃度的增加而增加，當OTA-BSA濃度達到
5.0ug/ml的以后，再增大OTA-BSA的濃度，響應電流增大不明顯，說明5.0ug/ml已經達到OTA-BSA的最佳濃度。
[0131]3.同理，為考察ant1-OTA濃度大小對使用電化學免疫傳感器的影響，本實驗采用了不同濃度的(1.25,2.5,5.0,10.0, 20.0ug/ml) ant1-OTA,然后進行差分脈沖伏安掃描。如圖6可見，ant1-OTA最佳濃度為5.0ug/ml。
[0132]4.同理,為考察AP-ant1-antibody濃度大小對使用電化學免疫傳感器的影響,本實驗采用了不同稀釋比例的(I:50,1:100,1:200,1:300，I:400V/V) AP-ant1-antibody,然后進行差分脈沖伏安掃描。如圖7可見，AP-ant1-antibody最佳稀釋比例為1:200(V/V) O
[0133]5.同理，為考察α-ΝΡ濃度大小對使用免疫傳感器的影響，本實驗采用了含不同濃度a -NP(0.25,0.5,0.75，1，1.5mg mL—1)的免疫反應緩沖體系，然后進行差分脈沖伏安掃描。如圖8可見，α -NP的最佳濃度為0.75mg mL'
[0134]實施例4制備的電化學免疫化學傳感器的性能分析
[0135]為了評估電化學免疫傳感器的性能，對以PBS(pH7.4)配備的不同濃度的OTA標準品進行分析。具體的，在最優實驗條件下，(I)將5μ L用PBS(pH7.4)稀釋到五個不同濃度的 OTA (200ng/ml, 20ng/ml, 2ng/ml, 0.2ng/ml, 0.02ng/ml)和 5μ LlO μ g mL 1 的 OTA 單克隆抗體(ant1-OTA)均勻混合，滴加在修飾了 OTA-BSA的電極OTA-BSA-SWNTs/CS/GCE表面，37°C溫育90min。在反應過程中，電極上固定的OTA-BSA與游離在混合液中的OTA共同競爭固定量的ant1-OTA。(2)然后再用PBS緩沖液(pH7.4)清洗電極，置于10 μ L1: 200稀釋的堿性磷酸酶標記馬抗小鼠IgG (H+L) 二抗中，37°C溫育90min，PBS緩沖液(pH7.4)清洗。采用DPV法記錄電流值ip (如圖9所示)，繪制標準曲線，如圖10所示。實驗結果顯示，當OTA濃度在1pg mL—1到10ng mL—1之間時，得到的峰電流與OTA濃度的對數呈線性相關，回歸方程為:Y = 6.3155Ε_6-2.89458Ε_6Χ。相關系數為0.999。將傳感器在只含有5ug mL—1的ant1-OTA而不含OTA標準品進行競爭的空白溶液中連續掃描10次，根據空白信號加上3倍標準差所對應的信號值估計檢出限，計算得4pg mL—1。
[0136]實施例5制備的電化學免疫傳感器的特異性分析
[0137]電化學免疫傳感器的特異性，在分析不分離的生物樣本中的生物標志物時具有重要的作用，主要取決于抗體的特異性。我們所使用的是OTA單克隆抗體。為了評價本免疫傳感器的特異性，我們對在檢測OTA時可能會出現的其他的三種真菌毒素黃曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)、伏馬菌素B1(FB1)進行了檢測。具體的，將黃曲霉毒素B1 (AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)、伏馬菌素B1 (FB1)各I μ g mL—1以及10ng mPOTA分別采用同實施例4所構建的電化學免疫傳感器進行測定。結果如圖10所示，其它的三種真菌毒素的DPV響應電流接近于空白樣(不含0ΤΑ)，然而OTA的DPV響應電流有明顯的下降。這些結果說明制備的電化學免疫傳感器能夠有效地分辨不同種類的真菌毒素，具有良好的特異性。
[0138]實施例6制備的電化學免疫傳感器的穩定性和重現性分析
[0139]在最優實驗條件下，制備免疫傳感器。用不同批次的免疫傳感器對10ng mL—1和10pg mL.1的OTA進行了 3次平行測定，變異系數分別為3.56%和5.20%。表明，本發明制備的電化學免疫傳感器具有良好的穩定性和重現性。
[0140]上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用于限制本發明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬【技術領域】中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。
【權利要求】
1.一種檢測赭曲霉毒素A的電化學免疫傳感器，包括工作電極、參比電極和對電極，所述工作電極為先在基底電極表面修飾羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料，而后固定赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶聯物所得。
2.根據權利要求1所述的電化學免疫傳感器，其特征在于，所述羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料中，羧基化單壁碳納米管與殼聚糖的質量比為1:1?12:1。
3.根據權利要求1所述的電化學免疫傳感器，其特征在于，每個工作電極上，所述羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料中羧基化單壁碳納米管的質量為I?12ug。
4.根據權利要求1所述的電化學免疫傳感器，其特征在于，所述羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料中的羧基化單壁碳納米管與所述赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶聯物的質量比為 6.67:1 ?2400:1。
5.根據權利要求1所述的電化學免疫傳感器，其特征在于，所述參比電極選自飽和甘汞電極或銀氯化銀電極；所述對電極為鉬絲電極；所述基底電極選自玻碳電極。
6.根據權利要求1-5任一項權利要求所述的電化學免疫傳感器中的工作電極的制備方法，其特征在于，所述方法為先在基底電極表面修飾羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料，而后再固定赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶聯物。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述工作電極具體按照以下步驟制備: 1)制備羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料:將殼聚糖溶解于醋酸溶液中，制備殼聚糖溶液；將羧基化單壁碳納米管溶解于所得殼聚糖溶液中，得羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料混懸液； 2)工作電極的修飾及功能化: (1)基底電極表面處理:將基底電極表面進行拋光處理，使其表面光潔； (2)修飾單壁碳納米管/殼聚糖納米復合材料:將步驟I)中制備的羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料混懸液滴涂到步驟(I)中處理好的基底電極表面，晾干成膜，得到羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復合材料修飾電極SWNTs-COOH/CS/GCE ； (3)采用活化液活化所得SWNTs-COOH/CS/GCE中SWNTs-COOH上的羧基基團； (4)固定赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶聯物:在活化后的SWNTs-COOH/CS/GCE上加OTA-BSA,孵育，形成OTA-BSA-SWNTs-COOH/CS/GCE，BSA封閉非特異性吸附位點，即得工作電極。
8.一種檢測赭曲霉毒素A的檢測體系，包括如權利要求1-5任一項權利要求所述的電化學免疫傳感器、抗赭曲霉毒素A單克隆抗體、二抗和免疫反應緩沖體系。
9.一種檢測赭曲霉毒素A的方法，為采用如權利要求1-5任一項權利要求所述的電化學免疫傳感器或如權利要求8所述的檢測體系對樣品中的赭曲霉毒素A進行檢測。
10.如權利要求1-5任一項權利要求所述的電化學免疫傳感器或如權利要求8所述的檢測體系在檢測赭曲霉毒素A中的用途。
【文檔編號】G01N33/577GK104198714SQ201410464586
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月12日 優先權日:2014年9月12日
【發明者】邱景富, 李朝睿, 張弦 申請人:重慶醫科大學