檢測尿液Clusterin含量試紙條的制備及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測尿液Clusterin含量試紙條的制備及應用，用于急性腎損傷和藥物腎毒性安全性監測，屬于疾病檢測【技術領域】，本發明提供的Clusterin膠體金試紙條，基本原理為雙抗夾心法，在硝酸纖維素膜的兩端分別設有金標墊和吸收墊，金標墊上端為樣品墊，金標墊包被有純化的單克隆Clusterin抗體1膠體金偶聯標記物，檢測線包被有純化的單克隆Clusterin抗體2，質控線包被有正常羊抗小鼠IgG抗體，質控線側貼有吸收墊，該試紙條操作簡單，無需儀器，結果易于判斷，且檢測手段無創，制備試紙條所用單克隆抗體為雜交瘤技術自行制備，費用低，適用于工業化生產。
【專利說明】檢測尿液Cluster in含量試紙條的制備及應用
【技術領域】
[0001] 本發明是一種急性腎臟損傷疾病的檢測方法，具體涉及一種應用免疫膠體金技術 研制的Clusterin檢測試紙條，同時公開了其制備方法，屬于疾病檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 急性腎損傷在臨床是常見而嚴重的腎臟病變，其發病率和死亡率都很高，尋求 具有高敏感性、特異性、易檢測的新的腎損傷標志物一直是研究熱點之一。簇集蛋白 (Clusterin)是一種分子量為80KD的異二聚體糖蛋白，廣泛存在于人類及動物的許多組織 中，急性腎損傷（acute kidney in jury, AKI)時，尿簇集蛋白表現出抗凋亡作用，并與脂肪 利用、細胞聚集及黏附有關。雖然它在多種組織廣泛表達，但由于其相對分子質量較大，不 能從腎小球濾過，因此只有在腎損傷時才能在尿中檢測。動物研究表明當腎毒素、腎切除術 后、多囊肝性腎病和腎細胞瘤引起的急性腎損傷時，Clusterin能在腎損傷后的去分化腎細 胞中表達增加，在鼠、狗和靈長類動物的尿中均可檢測出來。因此檢測尿中Clusterin水平 可以間接評價急性腎損傷和藥物腎毒性的情況。
[0003] 目前國內外檢測Clusterin的方法包括免疫組化、ELISA、Western blot、PCR等， 但用于臨床則存在很多弊端，如有創、操作程序復雜、時間較長等。
【發明內容】
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[0004] 本發明的目的是公開一種用于檢測尿液Clusterin含量的膠體金試紙條及制備 方法，用于急性腎損傷和藥物腎毒性安全性監測。
[0005] 本發明提供的Clusterin的膠體金試紙條，適用于工業化生產，基本原理為雙抗 夾心法，具體安裝方法參考了中國專利99203566. X、200510200394. 6等，在硝酸纖維素 膜的兩端分別設有金標墊和吸收墊，金標墊上端為樣品墊，金標墊包被有純化的單克隆 Clusterin抗體1膠體金偶聯標記物，檢測線包被有純化的單克隆Clusterin抗體2,質控 線包被有正常羊抗小鼠 IgG抗體，質控線側貼有吸收墊。
[0006] 本Clusterin的膠體金試紙條的制備，包括以下步驟：
[0007] 1將自行制備的純化單克隆Clusterin抗體1用膠體金標記，噴點于玻璃纖維膜 上制備成金標墊，將自行制備的純化單克隆Clusterin抗體2和正常抗小鼠 IgG抗體分別 包被在硝酸纖維素膜（NC膜）上的檢測線處和質控線處，當被檢樣品中含有Clusterin抗 原時，則于金標墊與膠體金標記的Clusterin抗體結合，并在吸收墊的作用下，向前滲透泳 動，與檢測線上的Clusterin抗體再次結合，出現肉眼可見的色帶。
[0008] 本發明試劑盒的使用方法如下：取尿標本約0. 1-0. 5ml加入小試管中，然后插入 試紙條，待1-2分鐘反應帶清晰后觀察結果（見圖2)。出現1條紅色（對照）沉淀線，為尿 檢診斷陰性；出現2條紅色（樣品和對照）沉淀線，為尿檢診斷陽性，未出現沉淀線則為無 效。
[0009] 本發明的積極效果在于：應用免疫膠體金技術制備Clusterin試紙條，可以快速， 靈敏檢測尿中Clusterin蛋白含量，避免了復雜的操作，無需特殊檢測儀器，結果易于觀察 判斷，可以適應多種檢測環境，無專業技術人員均可操作。樣本用量小，對操作者無毒性，并 且檢測手段無創，除可用于臨床急性腎損傷的檢測還可用于藥物腎毒性安全性監測。制備 試紙條所用單克隆抗體為雜交瘤技術自行制備，費用低。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010] 圖1.為Clusterin檢測裝置示意圖；
[0011] 圖2.為Clusterin試劑盒檢測結果判定不意圖；
[0012] 圖中：1 -樣品墊，2-金標墊，3-硝酸纖維素膜，4-吸水墊，5-PVC板，6-檢測線， 7_質控線。
【具體實施方式】
[0013] 實施例lClusterin單克隆抗體的制備
[0014] 用Clusterin蛋白（美國BD公司）多次免疫Balb/c小鼠，最后一次加強免疫后 第3天取免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞株X63-Ag8. 653雜交融合（融合劑為聚乙二醇）， 制備雜交瘤細胞，篩選能夠穩定分泌Clusterin單克隆抗體的細胞株制備抗Clusterin的 單克隆抗體1、2,測定單克隆抗體1、2效價，ELISA驗證2者混合后效價疊加，證明1、2是針 對Clusterin蛋白抗原上不同的抗原決定簇。
[0015] 實施例2Clusterin膠體金試紙條的制備：
[0016] 根據圖1所示，試紙條在硝酸纖維素膜的兩端分別設有金標墊和吸收墊，金標墊 上端為樣品墊，金標墊包被有純化的單克隆Clusterin抗體1膠體金偶聯標記物，檢測線包 被有純化的單克隆Clusterin抗體2,質控線包被有正常羊抗小鼠 IgG抗體，質控線側貼有 吸收墊。
[0017] (1)膠體金顆粒的制備：將1ml 1 %氯金酸溶液與99ml超純水混勻得終濃度為 0.01 %的氯金酸溶液，煮沸；吸取1 %檸檬酸三鈉1.6ml，將其一次并快速地加入煮沸的 氯金酸溶液中，溶液繼續加熱至淡黃色轉為藍黑色最終變為亮紅色，顏色穩定后繼續加熱 5min，室溫下冷卻，補充失水至原體積（見流程圖）。在透射電鏡下觀察，可見金顆粒大小基 本一致，分布均勻。測量100個膠體金顆粒直徑，計算平均直徑約20nm。
[0018] 膠體金顆粒的制備過程：
[0019]
【權利要求】
1. 一種檢測尿液Clusterin含量試紙條的制備，在硝酸纖維素膜的兩端分別設有金標 墊和吸收墊，金標墊上端為樣品墊，其特征在于：金標墊包被有純化的自制Clusterin單克 隆抗體1膠體金偶聯標記物，檢測線包被有純化的自制Clusterin單克隆抗體2,質控線包 被有正常羊抗小鼠 IgG抗體。
2. 根據權利要求1所述的Clusterin單克隆抗體1和單克隆抗體2,其特征在于 Clusterin單克隆抗體1和Clusterin單克隆抗體2為分別針對Clusterin不同抗原決定 簇的抗體，即結合位點不同。
3. 根據權利要求1所述的Clusterin單克隆抗體1和Clusterin單克隆抗體2,其特 征在于Clusterin單克隆抗體1和Clusterin單克隆抗體2均為采用小鼠雜交瘤細胞法制 備。
4. 根據權利要求1所述的一種檢測Clusterin含量的膠體金試紙條，其特征在于該試 紙條用于檢測人或動物尿液樣品。
5. 根據權利要求1所述的一種檢測Clusterin含量的膠體金試紙條，其特征在于該試 紙條在臨床急性腎損傷輔助診斷及藥物研究中腎毒性安全性監測的應用。
【文檔編號】G01N33/577GK104267187SQ201410549920
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月15日 優先權日:2014年10月15日
【發明者】于曉艷, 耿嘉男, 鄒穎剛, 石艷, 李相軍, 孫波, 苗春生, 劉凱 申請人:吉林大學
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