一種實體熒光納米微球及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種實體熒光納米微球及其制備方法和應用，屬于熒光檢測【技術領域】。本發明的實體熒光納米微球是由羧基羅丹明B與苯乙炔共價加成得到羅丹明B-苯乙烯，再由羅丹明B-苯乙烯與苯乙烯按照1:1～12的摩爾比聚合而成。本發明將熒光分子嵌入到聚苯乙烯的空間網絡中，得到的實體熒光微球具有微球間熒光強弱均勻一致、熒光強度高、信號放大倍數高等特點，由于微球表面沒有熒光分子的阻礙，微球能與蛋白進行高效率、高產率的偶聯。且該微球產生的熒光背景低，不會影響檢測結果的精確性，可廣泛應用于診斷試劑中。
【專利說明】一種實體熒光納米微球及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及熒光檢測【技術領域】，具體涉及一種實體熒光納米微球及其制備方法和在免疫定量層析中的應用。
【背景技術】
[0002]側向層析法在疾病快速診斷、小分子快速檢測等領域已得到了廣泛的應用。其原理是將特異性的抗原或抗體包被到硝酸纖維素膜上，構成檢測線，將二抗包被在距離檢測線2?3毫米的區域構成質控線。當樣本中的目標分子與帶有特定標記物的檢測抗體結合后，從硝酸纖維素膜的上樣端向吸水端層析。由于毛細管作用，復合物將沿著膜向前移動，但移動到檢測線時，樣品中的目標分子將被檢測線中的捕獲抗體捕捉而停留在檢測線上，多余的檢測抗體則通過檢測線后被質控線的二抗所捕捉。常用的標記物為膠體金顆粒、酶以及著色微球。膠體金顆粒和著色微球是通過靜電吸附將抗原或抗體標記到顆粒表面，通過觀察膠體金顆?；蛑⑶蛟跈z測線上的聚集顯色判斷檢測結果。而酶標記則通過催化底物顯色，顯示檢測結果。以上標記技術都是通過顯色和比色的方法來進行檢測，存在依靠肉眼識別、靈敏度低、無法精確定量等缺點。
[0003]傳統的側向層析產品主要是金標試紙卡。金標試紙卡是主要利用膠體金的電荷性通過靜電相互作用標記抗體、層析顯色的檢測技術，該技術主要用于定性檢測，如早早孕等產品。隨著CXD圖像技術的發展，膠體金發展出半定量產品，即通過T線和C線顏色的深淺進行定量檢測。但這種半定量檢測類似于照相比色定量技術，具有分辨率低，精確度低，誤差很大的缺點。
[0004]熒光標記技術具有靈敏度高、操作簡單等特點，已被廣泛用于生物檢測領域。如DNA測序、蛋白表達分析、細胞成像、活體成像、臨床診斷等。熒光微球技術是將聚苯乙烯羧基微球、熒光染料標記系統、激光技術、應用流體學及微球專用流式細胞儀等有機整合在一起的一項新技術，通過熒光微球信號來進行實驗數據采集和分析，具有快速分析多重生物反應的特點及高靈敏度和特異性，可用于抗原抗體、核酸探針檢測等領域的研究。
[0005]通常的熒光微球多為表面熒光微球，即將熒光分子通過特定的官能團偶聯到微球表面制得，表面熒光微球存在熒光較弱、均一性較差等不足。
【發明內容】
[0006]為了解決現有技術中的上述問題，本發明提供了一種實體熒光納米微球的制備方法。
[0007]本發明建立了一種基于近紅外突光分子的聚苯乙烯材料合成突光納米微球的方法，將近紅外熒光分子偶聯到苯乙烯分子上，通過聚合反應，整合到聚乙烯微球的分子內部。獲得的微球屬于實體突光微球，突光很強，突光均一'I"生很好。
[0008]本發明的技術方案:
一種實體熒光納米微球的制備方法，是將羧基羅丹明B與苯乙炔共價加成得到羅丹明B-苯乙烯，再由羅丹明B-苯乙烯與苯乙烯按照1:1?12的摩爾比聚合，獲得實體熒光納米微球。具體合成路線參見圖1和圖2。
[0009]聚苯乙烯是一種無色透明的熱塑性塑料，質地硬而脆，可以和多種染料混合產生不同的顏色。本發明所采用的熒光分子是羅丹明B，又稱玫瑰紅B、或堿性玫瑰精，俗稱花粉紅，是一種具有鮮艷桃紅色的人工合成的染料，吸收波長在540nm，屬于綠光區；最大發射波長在610nm，屬于紅光區。540nm的激發光脫離了紫外光區，能量較小，對生物體不會產生較高的背景熒光，而且與610nm的吸收波長相隔70nm的激發范圍，一般的生物材料產生的熒光達不到如此高的能量激發，因此產生的背景熒光更弱。
[0010]本發明將羧基羅丹明B分子和苯乙炔分子進行1:1加成反應，制得羅丹明B-苯乙烯，再將羅丹明B-苯乙烯和苯乙烯進行聚合反應，生成羅丹明B聚苯乙烯，再將羅丹明B聚苯乙烯制成不同粒徑的納米微球。
[0011]優選地，所述的實體熒光納米微球的制備方法，步驟如下:
(1)羅丹明B的DMSO(二甲基亞砜)溶液與苯乙炔的DMSO溶液混合，混合液中加入CuCl2的水溶液，混合得反應體系，再加水，在惰性氣體保護下攪拌反應2?4小時；
(2)步驟(I)反應結束后，加入SDS(十二烷基磺酸鈉)、CHPO (過氧化羥基二異丙苯)、TEPA (四乙烯五胺)，以及苯乙烯的DMSO溶液，惰性氣體保護下攪拌反應2?4h，獲得聚合物；
(3)聚合物經過離心，取沉淀洗滌，干燥，得到實體熒光納米微球。
[0012]優選地，步驟(I)所述羅丹明B的DMSO溶液中羅丹明B的濃度為0.1?lmol/L ；所述苯乙炔的DMSO溶液中苯乙炔的濃度為0.1?lmol/L ;所述CuCl2的水溶液中CuCl2的濃度為 0.05 ?0.5mol/L。
[0013]優選地，步驟(I)加水的量與反應體系的體積比為5?30:4。
[0014]優選地，步驟(2)所述苯乙烯的DMSO溶液中苯乙烯濃度為0.5?5mol/L。
[0015]優選地，所述惰性氣體為氮氣；步驟(2)攪拌速度為1000?5000rpm，反應溫度為41 ?43°C。
[0016]上述實體熒光納米微球的制備方法中，SDS作為乳化劑，CHPO和TEPA作為氧化-還原引發劑，其加入量可根據實際需要進行調整，實現其各自功能即可，例如SDS在整個體系的終濃度為1.42?50.00g/L,CHP0在整個體系的終濃度為0.82?29.00g/L，TEPA在整個體系的終濃度為0.65?23.00g/L。
[0017]由上述實體熒光納米微球的制備方法獲得的實體熒光納米微球也在本發明保護范圍之內。
[0018]本發明還提供上述實體熒光納米微球在制備熒光檢測試劑中的應用。
[0019]基于上述實體熒光納米微球，可以采用側向層析技術，制備近紅外免疫層析定量試紙條，例如硝酸纖維素膜上包被檢測線和質控線抗體。在檢測過程中，利用熒光掃描儀，分別掃描質控線和檢測線，激發熒光分子發光。熒光經濾光片過濾后，被傳感器捕捉轉換成電信號，經光電倍增管再轉換成數字信號。將質控線熒光強度校正檢測線熒光強度后代入熒光分析儀中的標準曲線，即可獲得樣本中待測物的含量。該方法與熒光分子直接標記到納米微球表面相比，屬于實體熒光，熒光更強、更穩定，顯著提高了檢測靈敏度，降低了背景熒光強度。該方法可廣泛用于食品、病毒、微生物、細胞因子、血液因子、毒品、危險化學品的快速定量檢測和應用。
[0020]本發明還提供一種熒光定量檢測試劑盒，包括:由本發明的實體熒光納米微球標記的檢測抗體和免疫層析試紙，檢測抗體能與待檢測物質特異性結合；所述免疫層析試紙為固定有檢測線和質控線的纖維層析材料，檢測線固定有與檢測抗體特異性結合的捕捉抗體，質控線固定有其他抗體，所述其他抗體能與檢測抗體結合但不與待檢測物質結合。
[0021]上述檢測試劑盒是利用夾心法檢測目標分子(待檢測物質)，檢測時，在免疫層析試紙的檢測線上固定的是與目標分子可以特異性結合的捕捉抗體，在質控線上作為參照物固定的是與目標分子和檢測線固定的分子無關的其他抗體，通常為山羊抗鼠多克隆抗體。熒光微球標記的檢測抗體被定量分裝到0.5mL EP管底部凍干保存。當含有目標分子的樣品與上樣緩沖液按1:1混勻，加入到檢測抗體的凍干管中，混勻，這時目標分子與溶解后的熒光微球標記的檢測抗體形成抗原抗體復合物。然后把它們滴加到試紙的濾血墊上進行層析。抗原抗體復合物及多余的沒結合抗原的熒光微球抗體隨溶液向試紙條上端移動。當抗原抗體復合物移動到檢測線時，被固定在檢測線上的捕捉抗體所捕獲，而未結合抗原的熒光微球抗體則被質控線的二抗所捕獲。反應結束后，用熒光掃描儀掃描檢測線和質控線的熒光的峰面積，并對峰面積進行積分。由于所使用的熒光微球的量一定，故以質控線的熒光的峰面積作為內參，通過計算檢測線與質控線熒光強度的比值，并且與標準工作曲線進行計算，就能夠得出樣品中目標分子的濃度。
[0022]本發明還提供一種熒光定量檢測試劑盒，包括熒光微球抗體混合物和免疫層析試紙；熒光微球混合物包括本發明的實體熒光納米微球標記的檢測抗體和鼠IgG，檢測抗體為能與待檢測物質特異性結合的單克隆抗體；免疫層析試紙為固定有檢測線和質控線的纖維層析材料，檢測線固定有與待檢物質特異性結合的BSA (牛血清白蛋白)偶聯物，質控線固定有羊抗鼠內參抗體。
[0023]上述檢測試劑盒是利用競爭法檢測目標分子(待檢測物質):在免疫層析試紙的檢測線上固定的是目標分子-BSA偶聯物，在質控線上固定的是內參羊抗鼠。微球管中預先干燥了兩種熒光微球抗體的混合物，分別是抗目標分子的單抗和鼠IgG。將樣品液和上樣緩沖液按1:1加入到微球中，混勻，滴加到試紙上，樣品中的目標分子與它的微球單抗結合，迅速通過檢測線和質控線；而多余的沒有飽和的微球單抗則被檢測線上的目標分子捕捉，鼠IgG則被羊抗鼠多抗捕捉在質控線。反應結束后，掃描熒光強度，通過標準曲線求出樣品中目標分子的濃度。目標分子濃度越高，則檢測線的熒光強度越弱。
[0024]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
1、本發明米用的實體突光微球技術不同于一般的表面突光微球技術。表面突光微球技術是通過活化分子，對微球表面的羧基或氨基進行活化后，將熒光分子通過取代反應偶聯到微球表面，反應過程由于必須在常溫常壓下進行，往往造成偶聯反應的不徹底，因此，得到的表面突光微球具有微球間突光強弱不均勻、突光強度低等缺點，還由于表面突光分子的覆蓋，往往還會造成蛋白分子偶聯的低效率和致死性。而本發明首先將熒光分子偶聯到苯乙烯分子上，合成得到熒光苯乙烯，再按一定的比例將熒光苯乙烯和苯乙烯混合，聚合成熒光聚苯乙烯。在聚合的過程中，熒光分子嵌入到聚苯乙烯的空間網絡中，得到實體熒光微球。本發明得到的實體熒光微球具有微球間熒光強弱均勻一致、熒光強度高、信號放大倍數高等特點，而且由于微球表面沒有熒光分子的阻礙，微球能與蛋白進行高效率、高產率的偶聯。而且，本發明采用的是羅丹明B，激發波長547nm，具有較高的能量，能完全激發微球內部熒光分子的活化；吸收波長610nm，屬于紅外波長，所產生的熒光背景低，不會影響檢測結果的精確性。
[0025]2、熒光微球用于診斷試劑，可以放大生物信號，極大提高靈敏度。根據粒徑的不同，本發明的每個實體微球中含有幾十至幾千個熒光分子，當標記了抗體的熒光微球與抗原偶聯后，單分子的抗原信號就被放大成幾百幾千倍的熒光信號，更易于被熒光掃描儀所捕捉。
[0026]3、實體熒光微球在側向層析快速檢測試劑的應用中可用于生產高精度的定量產品。本發明利用實體突光微球技術，將突光微球標記到抗體上，結合CMOS光感應技術,即使很微弱的熒光也可以捕捉到。因此，本發明所制備的快速檢測試紙具有高精度、高分辨率和低誤差的優點，屬于全定量檢測產品。本發明解決了傳統熒光微球熒光較弱、熒光均一性差、信號放大不穩定的問題，提高了檢測試劑中熒光的強度、均一性和靈敏度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1、是羅丹明B和苯乙炔水合成羅丹明B-苯乙烯的路線圖。
[0028]圖2、是苯乙烯和羅丹明B-苯乙烯按5:1的摩爾比聚合成羅丹明聚苯乙烯的路線圖，其中R基表示羅丹明B基團。
[0029]圖3是免疫層析卡示意圖，其中，I濾血墊，2硝酸纖維素膜，3檢測線，4質控線，5吸水墊。
[0030]圖4是NT-proBNP標準曲線，橫坐標為NT-proBNP濃度，縱坐標為信號值。
[0031]圖5是對NT-proBNP血液樣品的檢測結果圖，橫坐標為熒光掃描范圍，縱坐標為熒光強度。
[0032]圖6是對cTnl血液樣品的檢測結果圖，橫坐標為熒光掃描范圍，縱坐標為熒光強度。
【具體實施方式】
[0033]下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好地理解本發明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發明的限定。實施例中使用的試劑、藥品均為市售商品。
[0034]實施例1:實體熒光納米微球的合成
1、將I?IOmmol的羅丹明B溶解于IOmL的DMSO中。
[0035]2、將I?IOmmol苯乙炔溶解于IOmL的DMSO中，然后與羅丹明B的DMSO溶液混
口 ο
[0036]3、在步驟2的反應體系中加入20mL的I?IOmmol的CuCl2水溶液，在混合液中加入50?300mL的水，在室溫下以300rpm的轉速通氮氣保護攪拌反應2?4h。
[0037]4、在步驟3的反應體系中加入0.5?5g十二烷基磺酸鈉(SDS)作為乳化劑，
0.29?2.9g過氧化羥基二異丙苯(CHPO)和0.23?2.3g四乙烯五胺(TEPA)作為氧化-還原引發劑，5?50mmol的苯乙烯的IOmL的DMSO溶液作為反應劑，通入氮氣(N2),持續以1000?5000rmp的轉速攪拌，42°C聚合反應2?4h。[0038]5、將所得聚合物在8000~1000Orpm的轉速下離心，取沉淀，用乙醇洗滌后真空干燥，即為近紅外實體熒光納米微球(以下簡稱微球)，粒徑大小50~300納米。
[0039]表1不同轉速在聚合反應中對微球粒徑大小的影響
【權利要求】
1.一種實體熒光納米微球的制備方法，其特征在于，由羧基羅丹明B與苯乙炔共價加成得到羅丹明B-苯乙烯，再由羅丹明B-苯乙烯與苯乙烯按照1:1?12的摩爾比聚合，獲得實體熒光納米微球。
2.權利要求1所述的實體熒光納米微球的制備方法，其特征在于，步驟如下: (1)羅丹明B的DMSO溶液與苯乙炔的DMSO溶液混合，混合液中加入CuCl2的水溶液，混合得反應體系，再加水，在惰性氣體保護下攪拌反應2?4小時； (2)步驟(I)反應結束后，加入SDS、CHPO,ΤΕΡΑ,以及苯乙烯的DMSO溶液，惰性氣體保護下攪拌反應2?4h，獲得聚合物； (3)聚合物經過離心，取沉淀洗滌，干燥，得到實體熒光納米微球。
3.根據權利要求2所述的實體熒光納米微球的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述羅丹明B的DMSO溶液中羅丹明B的濃度為0.1?lmol/L ;所述苯乙炔的DMSO溶液中苯乙炔的濃度為0.1?lmol/L ;所述CuCl2的水溶液中CuCl2的濃度為0.05?0.5mol/L。
4.根據權利要求2所述的實體熒光納米微球的制備方法，其特征在于，步驟(I)加水的量與反應體系的體積比為5?30:4。
5.根據權利要求2所述的實體熒光納米微球的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述苯乙烯的DMSO溶液中苯乙烯濃度為0.5?5mol/L。
6.根據權利要求2所述的實體熒光納米微球的制備方法，其特征在于，所述惰性氣體為氮氣；步驟(2)攪拌速度為1000?5000rpm，反應溫度為41?43°C。
7.由權利要求1?6任一所述的實體熒光納米微球的制備方法獲得的實體熒光納米微球。
8.權利要求7所述的實體熒光納米微球在制備熒光檢測試劑中的應用。
9.一種熒光定量檢測試劑盒，其特征在于，包括:由權利要求7所述的實體熒光納米微球標記的檢測抗體和免疫層析試紙，檢測抗體能與待檢測物質特異性結合； 所述免疫層析試紙為固定有檢測線和質控線的纖維層析材料，檢測線固定有與檢測抗體特異性結合的捕捉抗體，質控線固定有其他抗體，所述其他抗體能與檢測抗體結合但不與待檢測物質結合。
10.一種突光定量檢測試劑盒，其特征在于，包括突光微球抗體混合物和免疫層析試紙； 熒光微球混合物包括由權利要求7所述的實體熒光納米微球標記的檢測抗體和鼠IgG，檢測抗體為能與待檢測物質特異性結合的單克隆抗體； 免疫層析試紙為固定有檢測線和質控線的纖維層析材料，檢測線固定有與待檢物質特異性結合的BSA偶聯物，質控線固定有羊抗鼠內參抗體。
【文檔編號】G01N21/64GK103940798SQ201410185839
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年5月5日 優先權日:2014年5月5日
【發明者】鄭忠亮, 吳瓊水, 蔡磊, 朱輝 申請人:武漢紐康度生物科技有限公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
