保留組織紋理結構使完整器官透明的方法及相應混合液的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種保留組織紋理結構、使完整器官透明的方法及相應混合液，其核心是配制一種包含糖類、離液劑和抗氧化劑的混合液/混合液組合。本發明所用混合液/混合液組合是粘度較低、無刺激性揮發氣味的透明液體，利用該溶液透明完整器官的方法操作簡便、透明速度快、透明效果好，透明過程中無需特殊防護，透明后器官形態大小不變，器官基本維持天然本色，器官內部天然紋理結構保留，并與其他常用熒光標記技術兼容，且本發明的方法作用力強，可使體型較大成年哺乳動物的器官透明。
【專利說明】保留組織紋理結構使完整器官透明的方法及相應混合液
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫學和透明標本制備領域，更具體地，涉及一種保留組織紋理結構、使完整器官透明的方法及相應混合液。
【背景技術】
[0002]全面準確地了解器官的內部結構及其神經血管走向情況是神經科學乃至整個生物醫學研究領域不可或缺的基礎，但組織不透明阻礙了對于大多數器官的全局式觀察。
[0003]組織透明技術(特別是整腦透明技術)使得器官不必切片，即可在完整狀態下進行觀察研究。現有組織透明技術包括美國專利US6472216中以及Chiang，A.S.等人提出的FocusClear 技術(參見 Chiang, A.S., et al.“Insect NMDA receptors mediate juvenilehormone b1synthesis，，，Proc Natl Acad Sc1.U S A 99,37-42 (2002))、Dodt, H.U.等人提出的 BABB 技術(參見 Dodt, H.U., et al.“Ultramicroscopy:three-dimens1nalvisualizat1n of neuronal networks in the whole mouse brain”，Nat.Methods4,331-336(2007))、PCT 專利 W02011111876A1、中國專利 CN102859344A 中以及 Hama，H.等人提出的 Scale 技術(參見 Hama, H., et al.“Scale:a chemical approach forfluorescence imaging and reconstruct1n of transparent mouse brain”， Natureneuroscience 14,1481-1488 (2011)) > Erturk, A.等人提出的 3DISC0 技術(參見 Erturk,A., et al.“Three-dimens1nal imaging of solvent-cleared organs using 3DISC0”，Nature protocols 7,1983-1995 (2012)), Ke, Μ.T.等人提出的 SeeDB 技術(參見 Ke，Μ.Τ., Fujimoto, S.&Imai, Τ.“SeeDB:a simple and morphology-preserving opticalclearing agent for neuronal circuit reconstruct1n，，， Nature neuroscience 16,1154-1161 (2013)) ,PCT 專利 W02014025392A1 中以及 Chung, K.等人提出的 CLARITY (參見Chung, K., et al.“Structural and molecular interrogat1n of intact b1logicalsystems”, Nature 497,332-337(2013))。
[0004]其中，FocusClear技術使用二甲基亞砜、泛影酸、泛影葡胺等成分，成本高昂，并且導致生物樣品嚴重皺縮，適用于處理昆蟲標本，無法使成年哺乳動物器官透明。
[0005]BABB技術和3DISC0技術均使用有機溶劑，處理后組織透明效果很好，但是處理后的組織嚴重皺縮，并且容易導致組織中熒光標記信號淬滅。此外，這些有機溶劑帶有強烈刺激性氣味，操作過程中常令操作者產生頭疼、惡心等不適。
[0006]Scale技術利用恒定濃度(4M或更高)的尿素和少量表面活性劑(如TritonX-100)組成的混合液持續浸泡器官。該方法透明需要時間較長，即便是對于新生小鼠整腦也至少三周以上。此外，Scale技術引起組織嚴重膨脹。
[0007]SeeDB技術使用濃度不斷增加的梯度果糖溶液浸泡組織,最后一步必須使用飽和濃度的果糖(質量體積分數為130% )，在透明速度和透明效果方面均優于單純使用尿素的方法。SeeDB技術組織形態保持良好，并與組織內熒光標記兼容良好，但往往導致組織變為棕褐色(即棕色變)。另外，115%以上濃度的果糖溶液非常粘稠，無論是更換溶液還是在溶液中操作組織樣品，均非常困難。特別是質量體積分數為130%的果糖溶液必須在37度下才具有微弱流動性，若溫度降低，該溶液即很快凝固或者造成果糖再度析出，從而影響組織透明或者妨礙觀察。
[0008]CLARITY技術利用電泳法去除組織中引起散射的脂類物質得以實現透明。該方法組織透明效果很好。不過，采用該方法透明組織需要使用特殊的水凝膠預先固定組織，并使用一套特殊的電泳裝置方可實現，且水凝膠儲存與灌注過程均需低溫條件，整個操作過程嚴格、繁瑣，最優實驗條件范圍很窄，難以推廣使用。此外，該方法因為溶脂造成細胞膜被破壞、組織天然紋理結構消失。
【發明內容】
[0009]為克服上述現有技術的不足，本發明的目的是提供一種兼具保留器官內部天然紋理結構、保存熒光標記信號的快速簡便的完整器官透明方法及相應混合液。
[0010]為了實現上述目的，作為本發明的一個方面，本發明提供了一種保留組織紋理結構、使完整器官透明的混合液，包含糖類、離液劑和抗氧化劑。
[0011]其中,所述糖類選自單糖和二糖中的至少一種。
[0012]其中，所述單糖為果糖。
[0013]其中，所述二糖為蔗糖。
[0014]其中，所述離液劑選自鹽酸胍、氯化鋰、尿素、硫脲中的至少一種。
[0015]其中，所述抗氧化劑選自巰基乙醇、3-巰基-1，2-丙二醇、硫辛酸中的至少一種。
[0016]其中，所述糖類的質量體積分數為10?100%。
[0017]其中，所述離液劑的質量體積分數為5?50%。
[0018]其中，所述抗氧化劑的質量體積分數為0.5?5%。
[0019]作為本發明的另一個方面，本發明還提供了一種保留組織紋理結構、使完整器官透明的混合液組合，所述梯度混合液組合包括N種如上任一項所述的混合液，其中所述N種混合液的糖類濃度逐漸增加，離液劑濃度逐漸降低，N為2-20之間的正整數。
[0020]其中，N為 5_10。
[0021]其中，當N = 5時，所述N種混合液的糖類的質量體積分數分別為10-40%、40-60 %、60-80 %、80-90 %、100 %。
[0022]其中，當N = 5時，所述N種混合液的糖類的質量體積分數分別為10-35%、35-40 %、40-60 %、60-90 %U00%o
[0023]作為本發明的再一個方面，本發明還提供了一種保留組織紋理結構、使完整器官透明的方法，包括下列步驟:使用如上任一項所述的混合液組合依次處理固定后的完整器官標本，實現透明；其中，體型較小動物的器官可依次在所述混合液組合的各種混合液中持續浸泡，體型較大動物的器官可依次經血管灌注所述混合液組合的各種混合液。
[0024]其中，先使用糖類濃度最小的混合液處理所述完整器官標本，再依次逐步使用濃度更大一級的混合液處理所述完整器官標本。
[0025]其中，對于濃度為10-40%的混合液需處理I?12小時，對于濃度為60_80%的混合液需處理I?4小時，濃度為100%的混合液需處理I?12小時。
[0026]其中，在使用所述混合液組合的各種混合液處理完所述完整器官標本之后，再使用糖類濃度為100%的混合液浸泡12-24小時。
[0027]通過上述技術方案可知，本發明整個操作過程簡單，不需要特殊實驗裝置；所用混合液無刺激性氣味揮發，不需要特殊防護，且透明效果確定、透明速度較快，不會引起組織嚴重變形、變色；本發明方法既能與常用熒光標記技術兼容，又能保留器官內部的天然紋理結構；此外，不僅可使體型較小成年哺乳動物的器官透明，也可使體型較大成年哺乳動物的器官透明。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1是本發明100%濃度的混合液溶液流動性測試的液面移動對比示意圖；
[0029]圖2是成年小鼠半腦標本經本發明實施例3的梯度混合液組合浸泡前后的對比照片;
[0030]圖3是分光光度計檢測的成年小鼠半腦標本經本發明實施例3的梯度混合液組合浸泡前后的透光率對比曲線圖；
[0031]圖4是成年小鼠整腦標本在透明前、SeeDB方法處理后及本發明實施例3方法處理后的顏色對比照片；
[0032]圖5是成年小鼠半腦標本經本發明實施例3的梯度混合液組合浸泡前后的形態對比照片；
[0033]圖6是熒光蛋白轉基因小鼠腦標本經本發明實施例3的梯度混合液組合浸泡后的雙光子顯微鏡圖像；
[0034]圖7是成年小鼠整腦標本在透明前及本發明實施例3方法處理后的高場強磁共振掃描圖像；
[0035]圖8是成年兔腦標本在動脈灌注本發明實施例3的梯度混合液組合前后的對比照片。
【具體實施方式】
[0036]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，以下結合具體實施例，并參照附圖，對本發明作進一步的詳細說明。
[0037]首先需要明確的是，質量體積分數，又叫“質量體積比濃度”或簡稱“質量體積比”，是指溶液中溶質的質量與溶液的體積之比，例如質量體積分數為10%的果糖溶液，即為100克果糖溶解于水中形成I升的果糖溶液，100克/升=0.1千克/升，消去單位換算成百分比簡寫為10%。
[0038]本發明提供了一種保留組織紋理結構、使完整器官透明的混合液，包含糖類、離液劑和抗氧化劑。糖類具有較高的折射率，用其處理組織，可以較好的匹配動物組織的折射率，使組織更透明；離液劑打破氫鍵，使蛋白質發生可逆性變性，它的加入增加樣品中膜蛋白的溶解性；抗氧化劑可以很好的阻止溶液變色以致變質。其中，糖類選自單糖(如果糖)和二糖(如蔗糖)的至少一種，糖類的質量體積分數為10?100%。離液劑選自尿素、硫脲、鹽酸胍、氯化鋰等的至少一種，離液劑的質量體積分數為5?50%。抗氧化劑可為選自3-巰基-1，2-丙二醇、巰基乙醇、硫辛酸等的至少一種，抗氧化劑的質量體積分數為0.5?5%。
[0039]優選地，本發明的混合液包含質量體積分數為10?100%的糖類，例如果糖，質量體積分數為5?50%的離液劑，例如尿素，以及質量體積分數為0.5?5%的抗氧化劑，例如3_疏基_1，2-丙二醇。
[0040]進一步優選地，本發明的混合液包括不同濃度梯度組成的多種混合液形成的一個混合液組合，優選由5?10種混合液組成，形成5?10級不同濃度的混合液。為了描述的方便，混合液組合中每一種混合液的濃度用其所含糖類的質量體積分數來表示。
[0041]優選地，所述混合液組合中所述各級濃度梯度組成的混合液的糖類濃度逐漸增力口，離液劑濃度逐漸降低。
[0042]再進一步優選地，本發明的混合液組合例如包括形成5級濃度梯度的5種混合液，其中糖類的質量體積分數分別為10-35 %、35-40 %、40-60 %、60-90 %、100 %，或者10-4040-6060-8080-90%、100%。最優選地，所述5級濃度梯度的5種混合液中糖類的質量體積分數分別為35%、40%、60%、80%、100%，或者40%、60%、80%、90%、100 %。離液劑的質量體積分數分別為45 %、45 %、35 %、25 %、10 %，抗氧化劑的質量體積分數均為0.5%。更優選地，糖類選用果糖，離液劑選用尿素，以及抗氧化劑選用3-巰基-1，2-丙二醇。
[0043]下面結合具體實例來闡述本發明的方法。本發明保留組織紋理結構的完整器官快速透明方法包括標本制備、本發明的混合液/混合液組合的配制、本發明的混合液/混合液組合處理器官三個步驟，下面區分體型較小和體型較大的哺乳動物進行詳細闡述:
[0044]1.體型較小的成年哺乳動物的完整腦標本制備:
[0045]成年小鼠一只，體重約20g，用Iml注射器抽取I %戊巴比妥鈉溶液0.2ml，腹腔注射麻醉。
[0046]待動物痛覺消失后，開胸充分暴露心臟，快速用裝有I XPBS溶液(pH7.4)的注射器自左心室進行心臟穿刺，5分鐘內均勻推注I X PBS溶液20ml，動物眼球、前肢及肝臟血色消失，繼續灌注4%多聚甲醛溶液20ml (pH7.4，IXPBS配制)。剛開始灌注多聚甲醛時，可見到動物抽動、甩尾，之后動物肢體和尾巴繃直，提示灌注成功。
[0047]剪開顱骨，小心分離剪斷與腦相連的顱神經，取出完整動物腦標本，浸入4%多聚甲醛溶液中，置于4°C冰箱內繼續后固定2小時以上，最好過夜。
[0048]其中，體型較小的哺乳動物和體型較大的哺乳動物是本領域技術人員公知的根據經驗來劃分的，通常認為實驗用動物中小鼠、大鼠等為體型較小的哺乳動物，兔、犬、馬、牛、猴等為體型較大的哺乳動物。
[0049]2.體型較大的成年哺乳動物的完整腦標本制備:
[0050]成年大白兔一只，體重約2kg，用5ml注射器抽取3%戊巴比妥鈉溶液2ml，耳緣靜脈注射麻醉。
[0051]待動物痛覺消失后，分離雙側頸總動脈，血管夾鉗夾近心端和遠心端，在中間段血管管壁剪開一小口，遠心端動脈插管，動脈插管連接預先裝有I XPBS溶液(pH7.4)的輸液裝置，松開遠心端血管夾，分離雙側頸深靜脈并剪開。動物眼球變白后，繼續灌注4%多聚甲醛溶液200ml (pH7.4，I XPBS配制)。剛開始灌注多聚甲醛時，可見到動物頸部肌肉收縮，之后動物前肢繃直，提示灌注成功。
[0052]從頸部剪斷椎骨斷頭，保留頸總動脈插管備用，為避免破壞血管，暫不剪開顱骨取腦。
[0053]3.本發明的混合液和混合液組合的配制:
[0054]實施例1
[0055]對于本發明的混合液，作為一個具體實施例，例如糖類選擇果糖單獨一種，離液劑選擇尿素單獨一種，抗氧化劑選擇3-巰基-1，2-丙二醇單獨一種，配制10ml混合液，具體步驟如下:稱取40克果糖、45克尿素溶解于90ml左右的雙蒸水中，并加入0.5克3-巰基-1，2-丙二醇混合均勻，靜置，待液面穩定后補加雙蒸水將得到的溶液體積調整到10ml。
[0056]實施例2
[0057]對于本發明的混合液，作為另一個具體實施例，例如糖類選擇1:1的果糖和蔗糖，離液劑選擇硫脲單獨一種，抗氧化劑選擇硫辛酸單獨一種，配制10ml混合液,具體步驟如下:稱取30克果糖和30克蔗糖、35克硫脲溶解于90ml左右的雙蒸水中，并加入0.5克硫辛酸混合均勻，靜置，待液面穩定后補加雙蒸水將得到的溶液體積調整到100ml。
[0058]上述實施例1、2僅是舉例說明，對于其它濃度的本發明混合液，可以相同步驟將其溶解于雙蒸水中混合均勻，靜置后再調整體積到100ml。
[0059]實施例3
[0060]對于本發明的混合液組合，作為一個具體實施例，例如分為5級，每級濃度溶液各配制100ml。其中，糖類選擇果糖單獨一種，離液劑選擇尿素單獨一種，抗氧化劑選擇3-巰基-1，2-丙二醇單獨一種。稱取如下表所示重量的果糖、尿素溶解于雙蒸水中，并加入給定量的3-巰基-1，2-丙二醇混合均勻，靜置待用。具體配方見下表。
[0061]
【權利要求】
1.一種保留組織紋理結構、使完整器官透明的混合液，包含糖類、離液劑和抗氧化劑。
2.根據權利要求1所述的保留組織紋理結構、使完整器官透明的混合液，其中所述糖類選自單糖和二糖中的至少一種。
3.根據權利要求2所述的保留組織紋理結構、使完整器官透明的混合液，其中所述單糖為果糖。
4.根據權利要求2所述的保留組織紋理結構、使完整器官透明的混合液，其中所述二糖為蔗糖。
5.根據權利要求1所述的保留組織紋理結構、使完整器官透明的混合液，其中所述離液劑選自鹽酸胍、氯化鋰、尿素、硫脲中的至少一種。
6.根據權利要求1所述的保留組織紋理結構、使完整器官透明的混合液，其中所述抗氧化劑選自巰基乙醇、3-巰基-1，2-丙二醇、硫辛酸中的至少一種。
7.根據權利要求1所述的保留組織紋理結構、使完整器官透明的混合液，其中所述糖類的質量體積分數為10?100%。
8.根據權利要求1所述的混合液,其中所述離液劑的質量體積分數為5?50%。
9.根據權利要求1所述的混合液，其中所述抗氧化劑的質量體積分數為0.5?5%。
10.一種保留組織紋理結構、使完整器官透明的混合液組合，所述梯度混合液組合包括N種如權利要求1至9任一項所述的混合液，其中所述N種混合液的糖類濃度逐漸增加，離液劑濃度逐漸降低，N為2-20之間的正整數。
11.根據權利要求10所述的保留組織紋理結構、使完整器官透明的混合液組合，其中N為 5-10。
12.根據權利要求10所述的保留組織紋理結構、使完整器官透明的混合液組合，其中當N = 5時，所述N種混合液的糖類的質量體積分數分別為10-40%、40-60%、60-80%、80-90 %、100 %。
13.根據權利要求10所述的保留組織紋理結構、使完整器官透明的混合液組合，其中當N = 5時，所述N種混合液的糖類的質量體積分數分別為10-35%、35-40%、40-60%、60-90 %、100 %。
14.一種保留組織紋理結構、使完整器官透明的方法，包括下列步驟:使用如權利要求10至13任一項所述的混合液組合依次處理固定后的完整器官標本，實現透明；其中，體型較小動物的器官可依次在所述混合液組合的各種混合液中持續浸泡，體型較大動物的器官可依次經血管灌注所述混合液組合的各種混合液。
15.根據權利要求14所述的保留組織紋理結構、使完整器官透明的方法，其中先使用糖類濃度最小的混合液處理所述完整器官標本，再依次逐步使用濃度更大一級的混合液處理所述完整器官標本。
16.根據權利要求14或15所述的保留組織紋理結構、使完整器官透明的方法，其中對于濃度為10-40%的混合液需處理I?12小時，對于濃度為60-80%的混合液需處理I?4小時，濃度為100%的混合液需處理I?12小時。
17.根據權利要求14至16任一項所述的保留組織紋理結構、使完整器官透明的方法，其中在使用所述混合液組合的各種混合液處理完所述完整器官標本之后，再使用糖類濃度為100%的混合液浸泡12-24小時。
【文檔編號】G01N1/28GK104198234SQ201410364956
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】侯冰, 張丹, 蔣田仔 申請人:中國科學院自動化研究所
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
