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一種葡萄糖的比色檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種葡萄糖的比色檢測方法，是將樣品經(jīng)預(yù)處理、加緩沖液稀釋后與葡萄糖氧化酶混合，反應(yīng)生成過氧化氫，然后加入二硫化鉬溶液、顯色劑和緩沖液，混合反應(yīng)后，采用目視比色法或紫外-可見分光光度計測定得出樣品中葡萄糖的含量。本發(fā)明利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成過氧化氫，再以二硫化鉬為催化劑催化過氧化氫與顯色劑的顯色反應(yīng)，采用目視比色法半定量測定葡萄糖濃度，或通過紫外分光光度計定量測定葡萄糖濃度。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中對葡萄糖檢測的操作要求高，檢測過程復(fù)雜，檢測成本高，檢測時間長，背景干擾大等問題，本發(fā)明的方法成本低、操作簡便、能夠?qū)崿F(xiàn)可視化快速檢測樣品中葡萄糖含量。
【專利說明】—種葡萄糖的比色檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于葡萄糖檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種葡萄糖的比色檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來由于飲食結(jié)構(gòu)的改變、生活節(jié)奏的日趨緊張以及少動多坐的生活方式等諸多因素的影響，全球糖尿病的發(fā)病率增長迅速，使糖尿病成為繼腫瘤、心血管病變之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病。血清中葡萄糖含量的檢測是臨床檢驗和監(jiān)控糖尿病的主要手段。目前用于血清葡萄糖含量檢測的國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)參考方法(標(biāo)準(zhǔn)號:WS/T 350-2011)是采用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶聯(lián)合的方法。這些天然酶在溫和條件下具有較高的底物特異性和催化效率，但是天然酶存在純化困難、易失活、不易保存、價格較高等缺點。在目前已經(jīng)公布的葡萄糖含量檢測相關(guān)專利中，主要為電化學(xué)方法(專利號:200710176028.0 ;專利號:200910067282.6 ;專利號:201010617684.1 ；專利號:201110083906.0 ;專利號:201110391001.X ；專利號:201110343243.1 ；專利號:201110345081.5 ;專利號:201220071992.3 ;專利號:201210189645.5 ;專利號:201210416267.X ;專利號:201310087177.5 ;專利號:201310141232.4 ;專利號:201310290148.9 ;專利號:201310354574.4)。電化學(xué)檢測靈敏度高，但是容易受到血氧以及血液中其他電活性物質(zhì)的干擾，而且在檢測過程中需要消耗一定的能量，另外，電極的制備往往較為復(fù)雜且無法直觀判斷血清葡萄糖含量，需要專門的儀器。其他檢測葡萄糖的方法如共振散射光譜法(專利號:200810073470.5)、近紅外光譜法(專利號:98100787.2)、化學(xué)發(fā)光法(專利號:200910236714.1 ;專利號=201210509888.2)、熒光光譜法(專利號:200680029822.6 ;專利號:201310250093.9)等都需憑借昂貴的專業(yè)儀器并且在專業(yè)技術(shù)人員的操作下才能完成對葡萄糖的檢測。而葡萄糖快速測定的相關(guān)試劑盒(專利號:201210459910.7)、試紙(專利號:200410033020.5 ;專利號:201210579953.9)等因其構(gòu)造復(fù)雜，制作過程繁瑣，價格昂貴，在實際應(yīng)用中也受到很大的限制。基于酶催化體系的比色檢測法是近年來較熱門的檢測方法，它利用反應(yīng)過程中體系顏色及色度的變化實現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測，具有檢出限低，靈敏度高的優(yōu)點，但是常需要使用過氧化物酶(HRP)，而過氧化物酶價格較高、易失活、不易保存。因此，又有人提出基于模擬酶檢測血清葡萄糖的方法。自中國科學(xué)院閻錫蘊課題組發(fā)現(xiàn)納米材料四氧化三鐵具有類過氧化物酶催化活性(NatureNanotechnology, 2007, 2, 577-583)以來，汪爾康等人利用該特性實現(xiàn)了對過氧化氫和葡萄糖的檢測(Analytical Chemistry, 2008,80, 2250-2254),氧化石墨烯也被發(fā)現(xiàn)具有類過氧化物酶活性，并已應(yīng)用于過氧化氫和葡萄糖的檢測(Advanced Materials, 2010，20，2255-2262)。在申請的專利中，人們也提出基于模擬酶比色檢測葡萄糖的方法(專利號:201110275358.1 ;專利號:201310244132.4 ;專利號:201310260524.X)。然而這些方法成本高、顏色變化較為單一、不易保存攜帶。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種葡萄糖的比色檢測方法，利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成過氧化氫，再以二硫化鑰為催化劑催化過氧化氫與顯色劑的顯色反應(yīng)來檢測葡萄糖，可解決現(xiàn)有技術(shù)中對葡萄糖檢測的操作要求高，檢測過程復(fù)雜，檢測成本高，檢測時間長，背景干擾大等問題，本發(fā)明的方法成本低、操作簡便、能夠?qū)崿F(xiàn)可視化快速檢測樣品中葡萄糖的含量。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種葡萄糖的比色檢測方法，是將樣品經(jīng)預(yù)處理，加緩沖液稀釋后與葡萄糖氧化酶混合，反應(yīng)生成過氧化氫，然后加入二硫化鑰溶液、顯色劑和緩沖液進行顯色反應(yīng)，采用目視比色法，將反應(yīng)后的溶液顏色與比色標(biāo)準(zhǔn)系列進行比較，或在顯色反應(yīng)后加入硫酸溶液終止反應(yīng)，再采用目視比色法半定量測定葡萄糖的濃度。
[0005]所述比色標(biāo)準(zhǔn)系列的制備是將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品加緩沖液稀釋，配制成已知的不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與葡萄糖氧化酶混合反應(yīng)后，加入二硫化鑰溶液、顯色劑和緩沖液進行顯色反應(yīng)即得比色標(biāo)準(zhǔn)系列，或在顯色反應(yīng)后加入硫酸溶液終止反應(yīng)得到比色標(biāo)準(zhǔn)系列。
[0006]一種葡萄糖的比色檢測方法，是將樣品經(jīng)預(yù)處理，加緩沖液稀釋后與葡萄糖氧化酶混合，反應(yīng)生成過氧化氫，然后加入二硫化鑰溶液、顯色劑和緩沖液，顯色反應(yīng)后采用紫外-可見分光光度計測定溶液的吸光度，或在顯色反應(yīng)后加入硫酸溶液終止反應(yīng)，再采用紫外-可見分光光度計測定溶液的吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算葡萄糖的含量。
[0007]所述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立是將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品加緩沖液稀釋，配制成已知的不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與葡萄糖氧化酶混合反應(yīng)后，加入二硫化鑰溶液、顯色劑和緩沖液，顯色反應(yīng)后采用紫外-可見分光光度計測定在652 nm波長處的吸光度，或在顯色反應(yīng)后加入硫酸溶液終止反應(yīng)，再采用紫外-可見分光光度計在450 nm波長處測定吸光度，并以吸光度作為縱坐標(biāo)，葡萄糖的濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。
[0008]稀釋樣品和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品所用緩沖液的pH值為3-9。
[0009]顯色反應(yīng)中所用緩沖液的pH值為1-9。
[0010]顯色反應(yīng)的溫度為30?60 °C。
[0011]所用的顯色劑為3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽或鄰苯二胺。
[0012]本發(fā)明的顯著優(yōu)點是:
(I)本發(fā)明通過葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成過氧化氫，再由二硫化鑰催化顯色劑與過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，以指示葡萄糖的不同濃度。葡萄糖濃度不同，則溶液顏色及顏色深淺均不同；通過肉眼觀察即可判斷葡萄糖是否超標(biāo)，而不必借助任何儀器，因此檢測成本低，操作簡便。
[0013](2)本發(fā)明所使用的二硫化鑰無需修飾即可用于葡萄糖的檢測。
[0014](3)本發(fā)明中分光光度法檢測葡萄糖的檢測限可以達到I PM，線性范圍為5 UM到 150 uM (R2=0.9992)。
[0015](4)本發(fā)明的反應(yīng)條件溫和，檢測速度快，重現(xiàn)性好，且無需昂貴的檢測儀器，操作簡便，可實現(xiàn)葡萄糖的可視化快速識別和檢測。【具體實施方式】
[0016]標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的檢測:將20 μ L葡萄糖氧化酶溶液與180 μ L用緩沖液(pH3-9)配制的不同濃度的葡萄糖溶液混合,3(T60°C下反應(yīng)30 min,然后加入0.05 mL的二硫化鑰溶液、0.05 mL顯色劑和0.2 mL緩沖溶液(pH 1_9)，混勻，放置30 min后，利用目視比色法進行半定量分析，或利用紫外-可見分光光度法在652 nm波長處測定吸光度，進行定量分析；或者加入10 μ L 20% (V/V)硫酸溶液終止反應(yīng)后,利用目視比色法進行半定量分析或利用紫外-可見分光光度法在450 nm波長處測定吸光度，進行定量分析。
[0017]樣品中葡萄糖檢測:取30 μ L樣品，用水稀釋到50 μ L，然后加入500 μ LBa(OH)2溶液，混勻，再加入500 μ L ZnSO4溶液，混勻后在3880 rpm離心10 min。取200UL上清液，用緩沖液(pH 3-9)稀釋5倍，作為測試樣品。其他操作同標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的測定。[0018]所用的顯色劑為3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺、2，2_聯(lián)氮-二(3_乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽或鄰苯二胺。
[0019]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明:
實施例1
標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的檢測:將20 UL葡萄糖氧化酶溶液(10 mg/mL)與180 yL用醋酸-醋酸鈉緩沖液(10 mM,pH 3)配制的不同濃度的葡萄糖溶液混合,30 °C下反應(yīng)30 min,然后加入0.05 mL的二硫化鑰溶液(18 mg/L)、0.05 mL 2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(20 mM)和0.2 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(10 mM,pH I)，混勻，放置30 min后，利用目視比色法進行半定量分析，或利用紫外-可見分光光度法在405 nm波長處測定吸光度，進行定量分析。
[0020]血清葡萄糖檢測:取30 μ L血清樣品，用水稀釋到50 μ L，然后加入500 μ LBa(OH)2 溶液(0.11 Μ)，混勻，再加入 500 μ L ZnSO4 溶液(0.0765 Μ)，混勻后在 3880 rpm離心10 min。取200 μ L上清液，用醋酸-醋酸鈉緩沖液(lOmM，pH 3)稀釋5倍，作為測試樣品。其他操作同標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的測定。
[0021]實施例2
標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的檢測:將20 UL葡萄糖氧化酶溶液(10 mg/mL)與180 yL用Tris-HCl緩沖液(10mM，pH 9)配制的不同濃度的葡萄糖溶液混合，60°C下反應(yīng)30 min，然后加入 0.05 mL 的二硫化鑰溶液(18 mg/L)、0.05 mL 鄰苯二胺(0.3M)和 0.2 mL Tris-HCl緩沖溶液(10mM，pH 9)，混勻，放置30min后，利用目視比色法進行半定量分析，或利用紫外-可見分光光度法在450 nm波長處測定吸光度，進行定量分析。
[0022]血清葡萄糖檢測:取30 μ L血清樣品，用水稀釋到50 μ L，然后加入500 μ LBa(OH)2 溶液(0.11 Μ)，混勻，再加入 500 μ L ZnSO4 溶液(0.0765 Μ)，混勻后在 3880 rpm離心10 min。取200 μ L上清液，用Tris-HCl緩沖液(10mM，pH 9)稀釋5倍，作為測試樣品。其他操作同標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的測定。
[0023]實施例3
標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的檢測:將20 UL葡萄糖氧化酶溶液(10 mg/mL)與180 yL用Tris-HCl 緩沖液(10mM，pH 6.9)配制的濃度依次為 0μΜ、5μΜ、20μΜ、40μΜ、60 μ Μ、80 μ Μ、100 μ Μ、150 μ M的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液分別混合，37--C下反應(yīng)30 min,然后加入0.05mL 二硫化鑰溶液(18 mg/L)、0.05 mL 3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺溶液(12 mM)和0.2 mLTris-HCl緩沖溶液(10mM，pH 6.9)，混勻，在30°C下放置30 min后，利用目視比色法進行半定量分析，或利用紫外-可見分光光度法在652 nm波長處測定吸光度，進行定量分析；或者加入10 u L 20% (V/V)硫酸溶液終止反應(yīng)后，利用目視比色法進行半定量分析或利用紫外-可見分光光度法在450 nm波長處測定吸光度，進行定量分析。
[0024]結(jié)果顯示，隨著葡萄糖濃度的增加，二硫化鑰催化3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺進行顯色反應(yīng)的產(chǎn)物在652 nm左右的吸光度逐漸增大，相應(yīng)溶液的顏色由黃色逐漸變?yōu)闇\綠色，再由藍綠色變至藍色。加入硫酸終止反應(yīng)后，隨著葡萄糖濃度的增加，二硫化鑰催化3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺進行顯色反應(yīng)的產(chǎn)物在450 nm左右的吸光度逐漸增大，相應(yīng)的溶液的顏色由淺黃色逐漸變?yōu)樯铧S色，線性方程為Y=0.234+0.0114X (R2=0.9992)。
[0025]血清葡萄糖檢測:取30 UL血清樣品用水稀釋到50 yL，然后加入500 U LBa(OH)2 溶液(0.11 M)，混勻，再加入 500 u L ZnSO4 溶液(0.0765 M)，混勻后在 3880 rpm離心10 min。取200 U L上清液，用Tris-HCl緩沖液(10 mM,pH 6.9)稀釋5倍作為測試樣品，其他操作同標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的測定。
[0026]結(jié)果顯示，隨著血清中葡萄糖濃度的升高，測試樣品溶液顏色(藍色或深黃色)逐漸加深。
[0027]本發(fā)明利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成過氧化氫，再以二硫化鑰為催化劑催化過氧化氫與顯色劑的顯色反應(yīng)來檢測葡萄糖，隨著葡萄糖濃度不同，溶液顏色及顏色深淺均不同，通過肉眼觀察即可判斷葡萄糖是否超標(biāo)，而不必憑借任何儀器，因此檢測成本低，操作簡便。而分光光度法檢測葡萄糖的檢測限可以達到I PM，線性范圍為5 PM到150UM (R2=0.9992)。本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，檢測速度快，重現(xiàn)性好，可實現(xiàn)葡萄糖的可視化快速識別和檢測。
[0028]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種葡萄糖的比色檢測方法，其特征在于:將樣品經(jīng)預(yù)處理，加緩沖液稀釋后與葡萄糖氧化酶混合，反應(yīng)生成過氧化氫，然后加入二硫化鑰溶液、顯色劑和緩沖液進行顯色反應(yīng)，采用目視比色法，將反應(yīng)后的溶液顏色與比色標(biāo)準(zhǔn)系列進行比較，或在顯色反應(yīng)后加入硫酸溶液終止反應(yīng)，再采用目視比色法半定量測定葡萄糖的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖的比色檢測方法，其特征在于:所述比色標(biāo)準(zhǔn)系列的制備是將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品加緩沖液稀釋，配制成已知的不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與葡萄糖氧化酶混合反應(yīng)后，加入二硫化鑰溶液、顯色劑和緩沖液進行顯色反應(yīng)即得比色標(biāo)準(zhǔn)系列，或在顯色反應(yīng)后加入硫酸溶液終止反應(yīng)得到比色標(biāo)準(zhǔn)系列。
3.—種葡萄糖的比色檢測方法，其特征在于:將樣品經(jīng)預(yù)處理、加緩沖液稀釋后與葡萄糖氧化酶混合，反應(yīng)生成過氧化氫，然后加入二硫化鑰溶液、顯色劑和緩沖液，顯色反應(yīng)后采用紫外-可見分光光度計測定溶液的吸光度，或在顯色反應(yīng)后加入硫酸溶液終止反應(yīng)，再采用紫外-可見分光光度計測定溶液的吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算葡萄糖的含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的葡萄糖的比色檢測方法，其特征在于:所述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立是將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品加緩沖液稀釋，配制成已知的不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與葡萄糖氧化酶混合反應(yīng)后，加入二硫化鑰溶液、顯色劑和緩沖液，顯色反應(yīng)后采用紫外-可見分光光度計測定溶液的吸光度，或在顯色反應(yīng)后加入硫酸溶液終止反應(yīng)，再采用紫外-可見分光光度計測定溶液的吸光度，并以吸光度作為縱坐標(biāo)，葡萄糖的濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的葡萄糖的比色檢測方法，其特征在于:稀釋樣品和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品所用緩沖液的PH值為3-9。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的葡萄糖的比色檢測方法，其特征在于:顯色反應(yīng)中所用緩沖液的PH值為1-9。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的葡萄糖的比色檢測方法，其特征在于:顯色反應(yīng)的溫度為 3(T60°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的葡萄糖的比色檢測方法，其特征在于:所用的顯色劑為3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽或鄰苯二胺。
【文檔編號】G01N21/78GK103760161SQ201410035356
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月25日
【發(fā)明者】郭良洽, 林天然 申請人:福州大學(xué)